茉莉酸甲酯促进灵芝三萜生物合成的关键调控蛋白鉴定及其功能研究

Triterpenes from Ganoderma lucidum (LingZhi) are main pharmacological compounds. In our preliminary work, we have found that methyl jasmonate (MeJA) can significantly induce triterpenes biosynthesis in G. lucidum.Transcriptomic research based on cDNA-AFLP found 390 genes expressed differently under MeJA induction.In consideration of some regulational proteins never change in transcriptional level,but in protein level for function execution. In this work,isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) technology will be used to identify key proteins involved in the regulation network of triterpenes biosynthesis in response to MeJA. The mRNA levels and protein levels of those genes will be investigated by real time and western blot. Furthermore, the function selected key genes in tritepenes biosynthesis in G. lucidum will be studied though over-expression and gene silence of the gene. These researches will help to further elucidate the mechanism of triterpenes biosynthesis network regulation, and provide theoretical basis for improving content of tritepenes in G. Lucidum. At the same time, it will help us to understand physiological function of tritepenes biosynthesis and provide reference for studying on other terpenoid compounds biosynthesis.

灵芝三萜是灵芝主要药用成分，其含量的多少决定了灵芝药用价值的高低。申请者前期研究发现外源添加MeJA对灵芝三萜生物合成具有明显的促进作用，基于cDNA-AFLP的转录组研究发现390个基因发生差异表达。鉴于部分调控蛋白可能在转录水平没有变化，而是通过其蛋白水平的变化发挥功能。本项目拟在前期研究的基础上，通过基于iTRAQ技术的定量蛋白质组学方法，1）对MeJA诱导下灵芝蛋白组进行解析，通过生物信息学分析和基因功能验证手段，筛选并鉴定参与灵芝三萜生物合成调控的信号转导、转录调控、蛋白修饰等相关的关键调控蛋白；2）对前述蛋白的编码基因进行过表达和基因沉默,考察灵芝三萜的变化，并检测三萜合成途径中关键酶基因的表达变化,进而解析MeJA调控灵芝三萜合成的可能机理。研究结果将进一步阐明MeJA促进灵芝三萜生物合成的分子机制，加深人们对大型担子菌次生代谢调控的了解，为其它重要萜烯类化合物研究提供借鉴。

灵芝三萜的含量是衡量灵芝药用价值的重要指标。灵芝三萜作为一种次生代谢产物，其生物合成受到诸多生物非生物因素的影响。申请者前期研究发现外源添加MeJA对灵芝三萜生物合成具有明显的促进作用，并对其调控机制进行了初步研究。本项目在前期研究的基础上，利用iTRAQ技术对MeJA诱导下灵芝蛋白组进行了解析，发现在MeJA的诱导下，灵芝菌丝蛋白质组有352个蛋白差异表达在1.5倍以上，其中，MeJA处理15min时，灵芝菌丝蛋白组即有明显响应，有235个差异蛋白，其中上调135个，下调100个；MeJA处理24h时，灵芝菌丝蛋白质组有223个差异蛋白，其中上调62个，下调161个。用Omicsbean软件进一步的生物信息学分析显示，MeJA诱导处理对灵芝菌丝的细胞周期、细胞壁完整性、氧化还原平衡、线粒体形态功能、细胞能量代谢等生理过程均有显著影响。为进一步的验证蛋白质组学的研究结果，我们开展了基于GC/MS、LC/MS的非靶向代谢组学研究，对实时代谢物动态变化进行监测，显示糖酵解加强，萜烯类次生代谢合成加强，cAMP含量上升显著，提示细胞增殖将受到抑制，与实验表型观察到的结果一致，也与itraq结果高度一致，提示MeJA诱导处理对灵芝菌丝的生长产生抑制，代谢物积累。L-苹果酸、alfa-酮戊二酸等在MeJA处理后明显减少，提示菌丝的TCA能量代谢循环可能受到影响。在此基础上，我们筛选并鉴定了一些参与灵芝三萜生物合成调控的相关蛋白，并对ugp、PacC两个基因开展了功能研究，发现ugp在灵芝菌丝发育过程中具有重要功能，对菌丝分叉、细胞壁完整性以及细胞壁组分、胞外Ca2+内流、以及灵芝多糖合成均有影响。pH相关转录因子PacC对于灵芝菌丝生长对抗ph变化不可或缺，PacC沉默后，菌丝生长明显减慢，约比正常菌丝生长速度减慢1/3,且突变株无法形成子实体。此外，在本项目的资助下，我们还发展了一种基于乙酸的更廉价的诱导刺激代谢物积累的新方案，并对其可能的机理进行了初步研究。综上，本项目对灵芝三萜的合成调控机制的初步研究，可为其他高价值萜烯类化合物的生物合成调控机制研究提供有益参考。