植物关键microRNA的光电化学可视化高灵敏检测研究

MicroRNA (miRNA) is a class of small noncoding RNA molecules with significant role in regulating gene expression at post-transcription level, of which the varying expression in plant has been confirmed to be correlated with morphogenesis, floral transition, hormone response, signal transduction, as well as stressful reactions. Quantification of plant miRNA with high sensitivity and accuracy is the basis of such mechanism research. Photoelectrochemical (PEC) technique holds enormous potential compared to traditional miRNA detection technique because of its merits of high sensitivity, low background signal and simple instrument. Although with such intriguing characteristics, it still faces problems such as mono-signal acquisition mode, and deficiency in dealing with complex matrix. Herein, based on the outstanding anti-interfering ability of the magnetic beads coupled entropy-driven toehold-mediated DNA strand displacement (ETSD) reaction, which have been published on our previous reports, we propose an effective solution for sensitive miRNA detection in complex milieu. Besides, we design a novel PEC-visualized detection mode based on the combination of PEC and electrochromic process. This protocol would not only provide a solution for sensitive PEC miRNA detection in complex milieu, but also enhance the reliability and visiblity of the analytical result, which will promote the outdoor monitoring of plant miRNA assay.

MicroRNA（miRNA）是一类具有高度保守性的短链非编码RNA，参与植物体内各项生理过程，尤其在环境胁迫应答中起到重要作用。光电化学（PEC）生物检测技术与传统的miRNA检测技术相比，具有更低的背景信号和检测限，且设备简单、价格低廉，具有广阔的应用前景。然而，目前PEC生物传感器仍然面临着信号获取方式单一，处理复杂样品的能力不足等问题。据此，本项目将PEC过程和电致变色过程相结合，提出了一种新型PEC-可视化复合型检测模式，其中，可视化信号提供直观的初步判定结果，PEC信号进一步提供更为精确的检测数据，以期拓宽PEC技术的应用场景，改善使用体验。同时结合我们前期开发的基于磁珠偶联的熵增加的核酸支点链取代循环放大反应，增强该检测模式对复杂样品的处理能力，提高灵敏度。该方法可以实现植物体内miRNA的高灵敏检测，同时其直观、易于微型化的特点，还将为户外定点监测提供解决方案。

水稻安全生产关乎国家命脉，也是国家可持续发展的基础。本项目计划将PEC过程和电致变色过程相结合，构建新型PEC-可视化传感模式，既可以快速读取颜色变化的信号，具有直观、便捷的优点，又可以通过光电信号变化得到更为精确的数据，用于水稻体内关键miRNA的高灵敏检测，同时考察压力胁迫下作物miRNA的变化情况，为抗压机制研究和优化选种提供依据。首先针对水稻生长介质中的铜离子污染，开发了两种PEC可视化复合型传感器，样品中的Cu2+可以与CdS QDs发生反应，使PEC信号猝灭，同时引起对电极的颜色变化，得到可视化信号。其中，可视化信号可以作为现场筛查的快速半定量依据，PEC信号可以为后续进一步分析提供更准确的数据。该类传感器的构建，可以为稻田水中Cu2+的直观、快速、准确检测提供新方法，在多种场景下具有潜在的应用前景。在针对水稻miRNA的检测中，设计了包括熵增加的DNA支点链取代（ETSD）反应和DNA杂交链式反应（HCR）等多种核酸扩增方法，但由于并未达到理想的检测限，该部分工作调整为鉴定一个可以调节水稻在农药异丙隆（IPU）胁迫条件下表达量上调的细胞色素家族基因CYP76C6，并研究了其在水稻解毒代谢中的作用。利用分子生物学手段得到了该基因过表达（OEs）水稻株系和突变体（Cas9s）水稻株系，分析了其在IPU处理下生理指标的差异，证明了其参与水稻体内IPU的降解；此外，还对水稻体内IPU的代谢产物和结合产物进行了鉴定，确定了其相对含量。这部分工作将为水稻在IPU胁迫下的代谢机制提供数据参考，同时对于加强农作物食品安全具有重要意义。