III型内部核糖体进入位点（IRES）介导核糖体对不同翻译起始区识别敏感性的研究

For single-stranded positive-sense RNA viruses, 5'-UTR recognition by the 40S ribosomal subunit occurs and is driven by an RNA structure located within the message itself. This structure is termed as the internal ribosomal entry site (IRES). The specific initiation translation region has an important effect on the translational initiation efficiency, and each type of IRES has a tendency to choose the initiation translation region which has the specific nucleotides and codon usage pattern. However, there are few reports about effects of combination of type III IRES with an optimal initiation translation region on translational efficiency. During the analysis of the feature of genome of single-stranded positive-sense RNA virus, we have found some key positions in the initiation translation region, which may affect translational efficiency. Therfore, depending on the overlap PCR and site-directed mutagenesis,we plan to construct a series of eukaryotic expression systems which is composed of two reporter genes, IRES element and various initiation translation regions. By detection of translational efficiencies of the report gene with various initiation translation regions through transient transfection and western-blotting, the role of each initiation translation region leaded by the type III IRES in the translation efficiency of the report gene can be identified and the optimal initiation translation region for the type III IRES can be explored. These data may contribute to the investigation of translation initiation mechanism of RNA viruses.

内部核糖体进入位点(IRES)介导的翻译起始机制存在于多种正链RNA病毒中。翻译起始序列内部核苷酸类型和密码子使用模式对于病毒基因的翻译起始效率十分重要，不同类型IRES对翻译起始区识别的敏感性是不同的。然而，目前III型IRES所优先识别的翻译起始区及其对翻译起始效率的影响还未见系统研究报道。本实验室在前期研究RNA病毒进化的过程中初步确定了在翻译起始区内部影响翻译起始效率的关键位点。本项目在此基础上通过PCR融合技术和定点突变技术构建系列具有不同翻译起始序列和内参报告基因的真核表达质粒，依靠真核细胞瞬时表达和蛋白质检测技术来检测翻译起始序列区关键核苷酸和密码子使用模式的改变对靶基因翻译起始效率的影响，确定III型IRES介导核糖体所识别的最优翻译起始序列及不同翻译起始序列对基因表达效率的影响程度。为探索翻译起始序列对RNA病毒翻译效率的影响等科学问题提供理论依据。

RNA病毒在宿主细胞内的翻译起始模式主要分为两大类：(1) 依赖于5′ 端甲基化帽状结构 (GpppmG-) 介导核糖体对翻译起始密码子的识别来激发其下游基因的翻译起始事件 (2) 非依赖于5′ 甲基化帽状结构的翻译起始机制，即由内部核糖体进入位点介导核糖体对翻译起始密码子的识别并激发其下游基因的翻译起始事件。以III型 IRES元件介导的翻译起始序列内部的-3位和+4位核苷酸进行定点突变由此得到的16种翻译起始序列模式，并且将这16种表达质粒分别对CHO细胞、293T细胞和PK细胞进行瞬时转染，并且通过免疫学方法进行相关表达产物的检测，鉴定出在-3位和+4位出现何种核苷酸将有利于III型 IRES元件介导的下游基因的表达量最大。通过转染CHO细胞、293细胞和PK细胞，发现CHO细胞和293T细胞对16种表达质粒均可以正常表达相关报告基因。通过免疫学的相关检测手段针对这3种细胞所表达的特定质粒所携带的报告基因的检测表明，当-3位核苷酸为T并且+4位核苷酸为G的时候，IRES元件介导的下游报告基因的表达量最高；当-3位核苷酸为C并且+4位核苷酸为T的时候，IRES元件对下游报告基因的介导表达能力弱。此后，以携带有-3位核苷酸为T/+4位核苷酸为G的表达质粒为模板，利用定点突变技术将其所对应的翻译起始序列中的+5和+6位核苷酸进行定点突变，获得在+5和+6位具有特定核苷酸的双报告基因表达质粒。将这些表达质粒再次分别转染CHO细胞、293T细胞和PK细胞，然后利用免疫学检测手段进行相关报告基因的检测，发现+5和+6位核苷酸的变化对III型 IRES元件介导的下游基因的表达影响不显著。基于上述研究结果，III型 IRES元件介导下游基因的表达调控的强弱与翻译起始序列中的-3位和+4位核苷酸的种类有明显的相关性，而+5和+6位核苷酸的变化对III型 IRES元件介导下游基因的表达调控的影响没有明显的相关性。