黄牛重要功能基因拷贝数变异（CNV）的筛选和功能鉴定

近年来，功能基因拷贝数变异（CNV）及其遗传效应研究已引起科学界的广泛关注，并发现这些功能基因拷贝数变异与人类复杂疾病密切相关。由此推测，作为复杂性状的生长发育、肉质和繁殖等性状也可能与功能基因拷贝数变异存在密切关联。但是目前关于拷贝数变异的研究仅见于人类的复杂疾病以及灵长类动物的起源分化方面，在其它物种尤其是在家畜上的研究迄今尚未见报道。因此，本项目将以人类拷贝数变异数据库和本实验室在肉牛遗传多样性研究中确定的与中国黄牛重要经济性状相关的SNP数据库为基础，通过比对，筛选出与生长发育、肉质以及繁殖性状相关的20个候选基因作为研究对象，采用现代分子操作技术和分子生物学方法检测和筛选这些功能基因的拷贝数变异，通过基因组关联分析期望揭示这些拷贝数变异与中国黄牛生长发育、肉质以及繁殖性状存在的关联性，并通过活细胞检测、基因表达等技术鉴定其功能，为我国肉牛品种的选育和肉牛业的发展提供新的理论基础。

CNV作为具有较大遗传效应的基因组变异形式，其可能会对重要经济性状产生不可估量的影响，若在肉牛上开展研究，将会为肉牛分子育种提供新的理论基础。CNV作为基因组变异形式是对单碱基变异（SNP）研究的延伸和拓展。通过该项目，应用DNA池测序，PCR-SSC，酶切等各种实验手段对候选基因的CNV进行了检测，在7个候选基因（ADIPOQ,NPM,SREBP1c,Visfatin,RBP4, SIX6,Angptl6）中检测到了结构变异，通过关联分析显示这些变异影响黄牛的体尺，体重等经济性状。实验结果也显示候选基因法检测基因组CNV有一定的局限性。通过对位于ADIPOQ基因启动子区，NPM基因编码区的插入/缺失和SIX6基因终止密码子的变异功能研究结果显示，位于ADIPOQ基因启动子区的变异影响启动子的活性和mRNA表达水平，而位于NPM基因编码区的变异则影响了基因的部分功能。应用CGH芯片技术对黄牛全基因组CNV进行了检测。通过实验，在12个地方黄牛品种中检测到469个CVNR，在牦牛品种中检测到127个CVNR，在水牛品种中检测到147个CVNR，变异约占牛基因组的2.1%；变异在染色体上处于非随机分布状态，主要分布于3，5，7，8，15，17，18，29和X染色体上；约有20%的变异与功能基因相关。发现了中国黄牛CNV变化从北到南呈现逐渐增多的趋势。采用荧光定量PCR的方法对检测到的CNVR进行了验证。检测到的CNVR包含了229个功能基因，对这些基因进行GO分析，结果显示基因主要集中在膜及与免疫相关的功能上。还检测到7个在肌肉中表达的基因，一个与脂肪相关的基因CYP4A1（位于PPARr通路上），一个与生长相关的PLA2（位于GnRH通路上）。PLA2基因的mRNA在成年牛的脂肪表达量较高，而MYH3基因的mRNA在成年牛的肌肉表达量较高。最后，验证了不同的变异类型对PLA2基因的mRAN表达有显著影响。通过该项目的进行，首次揭示了拷贝数变异在中国地方黄牛的分布规律及其对功能基因的影响，实现了对中国黄牛基因组变异研究从点（SNP，单个功能基因）到面（CNV，基因组的所有功能基因)的覆盖。也筛选出了具备重要价值的变异，为中国黄牛的起源进化、品种鉴定、群体遗传学特征分析、标记辅助选择、疾病诊断和转基因工作等提供了理论基础等，为牛更好更快地开展分子育种提供重要的遗传信息。