RNA结合蛋白LIN41在精原干细胞命运决定中的作用

RNA binding protein (RBP) plays a key role in stem cell fate decisions. Spermatogonial stem cell (SSC) is the foundation of life-long spermatogenesis and an excellent model for the regulation of adult stem cell fate, but the function of RBPs in SSCs have not been well clarified. We have developed a method to profile the landscape of RBPs in SSCs and identified multiple RBP molecules with specific or preferential expression in SSCs. Of them, we find that LIN41, also called E3 ubiquitin ligase Trim71, is localized in mouse SSCs and spermatogonial progenitor cells. In vitro reduction of lin41 expression in cultured SSCs dramatically results apoptosis of cells, following the loss of culture within two weeks. We have further generated the conditional mouse model with testis-specific Lin41 deletion and found the testes become significantly smaller, and the epididymis are lack of mature sperm. Together, these preliminary data strongly indicate the essential requirement of lin41 in the testes. Our ongoing efforts including LIN41 immunoprecipitation, high-throughput sequencing of RNA isolated by crosslinking immunoprecipitation（HITS-CLIP）and gene sequencing are applied to dissect the underlying mechanism. Together with functional transplantation of SSCs, we are looking forward to novel ways to disclose the fate regulation of male germline stem cells.

RNA结合蛋白（RBP）在干细胞命运决定中起关键的作用。精原干细胞（SSCs）是雄性一生精子发生的基础，也是研究成体干细胞命运调控的良好模型，目前RBP在SSCs中的研究还十分缺乏。最近，我们发展了一个在特定细胞中全景式需找RBP分子的方法，并在SSCs中筛选到多个特异或优势表达的RBPs，其中，我们发现LIN41，也称作E3泛素连接酶分子TRIM71，在小鼠精原干细胞和早期精原前体细胞中特异表达。体外培养的SSC进行lin41表达敲减后，细胞凋亡显著增加，细胞在2周内基本丢失，此外我们构建lin41组织特异敲除小鼠，睾丸敲除Lin41后显著减小，附睾中精子完全丧失，提示LIN41及其相关的分子通路在SSC命运决定中发挥重要功能。目前，我们通过RBP免疫沉淀、HITS-CLIP及基因测序等方法，探讨其可能分子机制，并结合SSCs功能移植来探讨它对SSCs干性维持、自我更新或分化的潜在作用，

精原干细胞（SSCs）是连续精子发生的基础，也是研究成体干细胞命运调控的良好模型。转录后调控在细胞生命调控过程中具有中心作用，其通常需要RNA结合蛋白（RBPs）来发挥对细胞功能的调节，然而RBP在SSCs中的调节作用尚不清楚。. 本项目通过mRNA相互作用捕获，首次发现并报道了一系列RNA结合蛋白在调节SSC命运中发挥作用。其中，我们鉴定出的RNA结合蛋白LIN41，在小鼠睾丸中精原干细胞和未分化精原细胞中特异表达。LIN41条件性敲除后雄性小鼠睾丸较对照明显减小、雄性小鼠完全不育，附睾无精子。雄性小鼠睾丸横切面仅管腔基底部存在少量ZBTB16阳性生殖细胞；通过GFRA1（最原始的精原细胞标志蛋白）与ZBTB16荧光共染我们发现，成年ZBTB16阳性细胞中GFRA1百分比明显升高；此外，通过STRA8与ZBTB16荧光共染我们发现ZBTB16阳性细胞中STRA8百分比显著降低。敲除后组织的转录本测序显示分化相关基因转录本下调，下调的转录物在神经系统发育、转录调控、细胞分化、精子发生中的功能显著富集。LIN41的免疫共沉淀发现其与EWSR1相互作用，提示LIN41通过与伴侣蛋白EWSR1结合，调控精原干细胞的分化命运。. 此外，我们结合RNA结合蛋白谱系，筛查并验证了另外两个在生殖系统中富集表达的RNA结合蛋白TCFl5及ESRP1，首次发现并报道了Tcfl5在体内是单倍不足的，并作为一种双功能蛋白，通过调控DNA和RNA介导精子发生。RNA结合蛋白ESRP1作为剪切因子通过pre-mRNA的可变剪接，调控小鼠卵母细胞减数分裂进程、卵泡发育、以及排卵等过程。这些发现将有助于发现生殖系统发育过程中转录后调控的关键作用机制，为人类不孕不育的临床治疗提供新的思路。