CUL4B在肠道干细胞命运决定中的作用及其机制研究

CUL4B is the scaffold protein of E3 ubiquitin ligase. Loss of functional mutation of CUL4B leads to mental retardation and Cul4b knockout mice die of abnormal development at 8.5dpc, with mechanism still unclear. Our previous results indicated CUL4B complex catalyze H2AK119 monoubiquitination and associate with transcriptional repressive complexes to involve in epigenetic regulation. Further research showed that CUL4B is highly expressed at the bottom of intestinal crypt region and promotes self-renewal of crypt-villus units by cell signal mediating. The intestinal stem cells (ISCs), as the resource of all intestinal cells through self-renewal and cell differentiation, are important for intestine structure and function maintenance. What is the role of CUL4B in modulating intestine development and self-renewal? Does it works through ISCs modulating? To test this hypothesis, we will firstly study the expression profile of CUL4B in intestinal cells. Then we will investigate the role of CUL4B in cell fate decision of ISCs in Cul4b intestine-specific knockout mice. This research will provide clues to know the role and mechanism of CUL4B in intestine development and self-renewal by ISCs regulating, also provide the theoretical basis for discovery of new modulators and signal network in ISCs modulating.

CUL4B是泛素连接酶复合物的支架蛋白，其功能丧失导致人类及小鼠发育严重异常，但其在发育中的作用机制仍不明确。我们的研究结果表明CUL4B复合物单泛素化H2AK119，协同转录抑制复合物参与表观遗传调控。前期工作发现CUL4B在肠道隐窝底部干细胞区高表达，参与多个信号通路的调控，促进肠道的自我更新。肠道干细胞（ISCs）是肠道发育及肠上皮自我更新的源泉，其细胞命运决定对肠黏膜结构和功能维持至关重要，是成体干细胞研究的良好模型。那么CUL4B在肠道发育及更新中的作用是什么？这些作用是否通过调控ISCs而实现？因此，本课题拟从CUL4B在肠道细胞中的表达特性入手，以ISCs为研究对象，利用Cul4b肠道敲除小鼠模型探究CUL4B在ISCs命运决定中的作用及具体机制，为阐明CUL4B在肠道发育及更新中的作用、明确其调控肠道干细胞的机制提供线索，也为发现新的ISCs调控分子及信号网络提供理论依据。

CUL4B在哺乳动物发育中发挥重要作用，基因突变患者精神发育迟滞，基因敲除小鼠胚胎早期致死。本项目从CUL4B在肠道干细胞区域特异性表达的特性入手，以ISCs为研究对象，利用Cul4b肠道敲除小鼠结合体外类器官模型探究Cul4b在ISCs命运决定中的作用及具体机制，研究取得了以下结果：第一，明确了Cul4b在肠道干细胞细胞胞质特异高表达，与Lgr5+细胞以及潘氏细胞标记物共表达；第二，发现pVillin-Cre肠道特异Cul4b敲除导致肠道隐窝和绒毛长度变少，小肠自我更新速度变慢，过表达Cul4b小鼠中结果相反。第三，分析了Cul4b在肠道自我更新中的作用，高通量测序发现Cul4b敲除导致小鼠肠道干细胞标记物和潘氏细胞标记物表达降低。小肠干细胞数目、体外类器官形成能力和传代能力在pVillin-Cre肠道特异Cul4b敲除小鼠中显著下降。第四，组织及类器官高通量测序结果表明Cul4b对肠道干细胞的调控是通过beta-catenin及Wnt通路的调控实现的，Cul4b敲除小鼠表达谱与beta-catenin肠道敲除小鼠基因表达谱高度一致，ChIR99021或Wnt重组蛋白可以拯救Cul4b敲除引起的肠道类器官形成数目、出芽率及传代次数的减少和基因表达改变。第五，pVillin-Cre肠道特异性Cul4b敲除小鼠潘氏细胞数目减少，出现内质网结构紊乱、自噬小体溶酶体增多，Wnt3a等多种Wnt分泌蛋白减少，Lgr5-Cre特异性敲除Cul4b的类器官在分化培养基中没有显著差异。我们的结果表明Cul4b一方面通过正向调控beta-catenin表达维持Lgr5+肠道干细胞自我更新能力，另一方面通过参与潘氏细胞结构和代谢功能调控影响干细胞niche中的Wnt信号，我们的发现为肠道干细胞调控网络阐明了新的分子机制。