RNA结合蛋白Dnd1动态聚集在小鼠精原干细胞维持和热激耐受中的影响和分子机理研究

Post-transcriptional regulation mediated by RNA binding proteins plays crucial roles in spermatogonial stem cell (SSC) maintenance. RNA binding proteins interact with RNAs and prone to form aggregations named P granule or Stress granule, these non-membrane units in cytoplasm are implicated in mRNA metabolic pathways or signal transduction and are involved in cell homeostasis and stress responses. Heat stress has detrimental effect on mammalian spermatogenesis, however, whether and how protein aggregation pathway involved in this process is largely unknown; Dnd1 is a germ cell specific protein, loss of Dnd1 leads to primordial germ cell lost and infertility. Our previous study also showed that Dnd1 is required for P granule formation in embryonic germ cells. Preliminary data found Dnd1 mainly expressed in spermatogonial stem cell population in postnatal testis. In this study, we are planning to analyze functions and underlying mechanisms in SSC homeostasis and stress response, which mediated by Dnd1 protein aggregation. We will use 1) in vitro cultured SSC and 2) conditional knockout mouse as research model, and also use multiple methods like immuno-precipitation, proteomics, RNAi, protein structure analysis and testis phenotype analysis to uncover the molecular mechanisms in spermatogenesis.

RNA结合蛋白介导的转录后调控对精原干细胞维持至关重要，RNA结合蛋白也易与RNA在细胞质聚集形成P granule和Stress granule, 聚集可调控RNA代谢和信号转导等，参与细胞稳态维持和应激。哺乳动物精子发生对热激尤其敏感，RNA结合蛋白聚集参与该过程的研究还十分有限；Dnd1是生殖细胞特异RNA结合蛋白，该蛋白缺失导致原始生殖细胞凋亡，引发不育。Dnd1对胚胎期生殖细胞内聚集形成P granule是必须的，预实验结果显示，Dnd1在出生后小鼠睾丸中主要表达在精原干细胞。本研究以探讨Dnd1介导的蛋白聚集对精原干细胞维持和应激的作用和分子机理为出发点，离体条件下，通过体外培养的精原干细胞模型，在体条件下，用条件性基因敲除模型，结合免疫沉淀结合蛋白质组学、蛋白结构分析和RNAi等方法研究Dnd1介导的蛋白聚集对精子发生的影响，为精子发生的机理提供重要的理论支撑。

RNA结合蛋白介导的转录后调控对精原干细胞维持至关重要，RNA结合蛋白也易与RNA在细胞质聚集形成P小体, 聚集可调控RNA代谢和信号转导等，参与细胞稳态维持和应激。本研究以DND1为核心，取得以下主要进展，1）利用单细胞转录组学明确P小体介导的转录后调控相关基因和DND1在正常生精功能的人睾丸组织各类细胞组分表达情况，明确P小体在精原干细胞分化过程中的动态变化；2）利用条件敲除小鼠模型，验证DND1为精原干细胞P小体组装所必须，在未分化精原干细胞中敲除该基因会导致P小体无法形成，精原干细胞无法维持；3）通过体外纯化蛋白表征结合细胞生物学实验，证实DND1和NANOS2作为复合物决定了精原干细胞中P小体组装的程度，而P小体组装是未分化细胞维持干性所必须的。该结果为转录后调控机制在成体干细胞维持和分化过程提供了新的证据，补充了相分离在干细胞分化过程中的重要功能。在本项目与合作项目支持下，已发表SCI论文2篇，其中影响因子10以上1篇（Nature Communucations）均为共同通讯作者。已接受SCI 论文1篇（通讯作者）；投递SCI文章1篇（EMBO Journal）。基于本项目研究成果，提示影响细胞转录后调控，可以通过靶向生殖细胞中特异的RNA结合蛋白，基于本项目获得的理论，已经测试在应激胁迫相关疾病状态的细胞中，靶向RNA结合蛋白，调节P小体动态，以恢复生精功能。本项目完成为精子发生的机理提供重要的理论支撑。