单个型精原细胞特异转录因子Tbr2调控小鼠精原干细胞命运决定的分子机制

Maintaining normal activities of spermatogonial stem cells (SSCs) is essential for continual spermatogenesis. SSCs reside in a subpopulation of undifferentiated spermatogonia and their fate decisions are tightly controlled by intrinsic and extrinsic factors. The undifferentiated spermatogonial population consists of Asingle, Apaired and Aaligned spermatogonia with the Asingle contain enriched SSC activities. Currently, our knowledge about the molecular features and mechanisms underlying fate decisions of Asingle spermatogonia is limited. Our preliminary data revealed that expression of T-box transcription regulator Tbr2 is restricted to a subpopulation of the Asingle spermatogonia. Tbr2+ cells are part of Id4+ (40%) and Gfra1+ cells (27%) spermatogonia.The way of Tbr2+ cells to respond busulfan-induced germ cell damage indicates that this specific cell type likely contain enriched SSC numbers. To further decipher the role of Tbr2 in spermatogenesis, we propose to complete three specific aims: 1) identify the origin and SSC content of Tbr2+ spermatogonia, 2) investigate the molecular roles of Tbr2 in regulating SSC self-renewal by using loss-of-function and gain-of-function mouse models, 3) explore the downstream regulators and transcriptional network that mediate Tbr2 action. Successful completion of the proposed research will enhance our understanding of SSC biology and germ cell development. Knowledge gained from the proposed project may facilitate the development of diagnostic and therapeutic tools for treating male infertility and contraceptive.

维持精原干细胞正常功能是精子发生的基础。精原干细胞活性仅存在于少量未分化精原细胞中，其命运决定受内外源因子严格调控。未分化精原细胞包括单个型、成对型和链状型精原细胞，单个型被认为是干性最强的精原细胞。然而目前，我们对单个型精原细胞的生物学特性和命运调控机制缺乏了解。我们的前期实验发现，T-box转录因子Tbr2只在一部分单个型精原细胞表达。Tbr2+(阳性)细胞占Gfrα1+细胞的27%，Id4+细胞的40%。Tbr2+细胞对生殖细胞损伤的响应方式，也表示该细胞群有干细胞活性。为进一步揭示Tbr2在精原干细胞中的功能和作用机理，我们拟研究：1）Tbr2阳性精原细胞的来源和干细胞活性；2）生殖细胞特异Tbr2敲除和过表达小鼠表型鉴定；3）揭示Tbr2关键靶基因和调控网络。完成本研究有助于我们对精原干细胞和生殖细胞发育调控机制的理解，为治疗男性不育和开发抗生育方法提供理论支持。

维持精原干细胞增殖和分化的平衡是正常精子发生的基础。精原干细胞活性仅存在于少量未分化精原细胞中，其命运决定受内外源因子严格调控。未分化精原细胞包括单个型、成对型和链状型精原细胞，单个型被认为是干性最强的精原细胞，但目前我们对单个型精原细胞的基因表达特征和命运决定的调控机制缺乏了解。本项目的核心目标是解析精原干细胞命运决定的关键分子和调控网络。在前期实验中，我们发现了一类特异表达Tbr2的单个型精原细胞，以此为基础，利用Tbr2-gfp小鼠、Tbr2条件性敲除和过表达小鼠以及其它工具鼠，项目重点开展了三个方面的内容：1）解析了Tbr2阳性细胞的干细胞活性和基因表达特征；2）揭示了转录因子Tbr2在精原干细胞维持中的关键作用；3）研究了Tbr2调控精原干细胞命运决定的可能机理，筛选并验证了几个在未分化精原细胞特异表达并发挥重要的转录因子。研究发现：1）单细胞转录组和染色质开放状态检测发现，和传统的未分化精原细胞类型划分不同，在单细胞水平，未分化精原细胞可分为十个不同的类群，其中Tbr2阳性细胞是其中独特的一类，有不同于其他细胞的染色质开放状态、基因表达特征和细胞周期状态（处于静止期），且具有富集精原干细胞活性。2）条件性敲除实验表明，Tbr2敲除不影响正常精子发生，但在应激损伤时，敲除小鼠精子发生恢复的更完全，表明Tbr2可能是精原干细胞命运决定的负调控因子，条件性过表达实验证实了该观点。Tbr2过表达导致精原干细胞自我更新和分化过程紊乱，小鼠不育。3）结合Tbr2靶基因筛选和单细胞数据，利用体外培养的未分化精原细胞，构建了457个基因的CRISPR-Cas9筛选体系，发现其中的55个在未分化精原细胞增殖和维持中发挥重要作用。通过功能实验，发现转录因子Foxc2敲除可导致精原干细胞库受损，小鼠出现雄性不育表型。以上数据将显著推进对精原干细胞特征、转录调控途径和命运决定机理的认识，并为实现精原干细胞体内外命运调控和临床应用提供技术和理论支持。