结核杆菌结构蛋白抗原优势表位的鉴定及其在结核隐性感染诊断和疾病转归中的作用研究

It is believed that 1/3 population worldwide are afflicted with Mycobacterial tuberculosis (Mtb) infection. 90% of them is latent infection(LTBI), 10-20% develops to active Tb infection（ATBI）who needs early diagnosis and treatment.Novel diagnostic tools are needed to identify latent infection and to provide meaningful biomarkers to discriminate prognosis of latent infecion. Antigens predominantly expressed by dormant Mtb during LTBI are promising candidate immune markers for LTBI diagnosis and prognosis prediction. Therefore, this study aims at the screening LTBI associated antigens using MHC restriction, protein A affiliate chromatography and tandem mass spectrometry analysis. Automatically generated peak will be identified against Mtb database by the Global Proteome Machine and ProteinPilot. Differentially expressed proteins will be tested for their capacity to discriminate between LTBI and ATBI,and their functions to direct the disease development.The dissection of the cellular immune response with different dominent T cell antigens in progress of LTBI will enable novel strategies for monitoring LTBI development. Our findings will explore LTBI associated antigens as promising antigen for LTBI diagnosis and biomarkers for disease prognosis prediction.

据估计结核杆菌现感染全球1/3人口，其中90%为隐性感染。隐性感染人群是主要的结核传染源。早期诊断和治疗结核隐性感染是结核病防治的关键。γ干扰素释放实验是目前推广的结核病诊断实验，但其仅能检测结核活动期特异性抗原的免疫应答，不能诊断隐性感染。国内外对结核隐性感染特异性抗原的筛查及免疫应答的报道寥寥无几。我们首次对比研究筛选出4种MHC II类限制性的T细胞抗原表位，仅结核隐性感染小鼠中高表达，而结核活动期表达量很低。在此基础上，本研究拟在模拟自然感染的的动物模型和自然感染的人群中，采用蛋白A亲和层析和串联质谱分析法，系统鉴定结核杆菌北京基因型的MHC I类和II类分子限制性抗原表位，筛出免疫优势表位。进一步用MHC-抗原肽四聚体和流式细胞术，阐明结核隐性感染表位特异性T细胞增殖、杀伤和分泌细胞因子与疾病发生、发展的相互关系，寻求结核隐性感染的有效诊断和转归预测的实验方法。

项目背景——结核杆菌通过调节自身基因、蛋白表达和宿主免疫应答模式，决定着结核感染的结局。潜伏期感染人群是主要的结核传染源。早期诊断和治疗结核隐性感染是结核病防治的关键。目前研究多集中在活动期结核分泌蛋白的筛选，缺乏系列研究结核潜伏期感染所表达的蛋白，以及与疾病发生、发展和预后的相互关系研究。.主要研究内容——本研究针对结核潜伏期感染，使用MHC限制性和蛋白A层析系统，筛选出潜伏期感染所表达的优势蛋白，通过体外载体构建和重组蛋白的表达，进一步研究不同潜伏期感染蛋白的免疫作用和免疫机制。探讨结核潜伏期感染转归风险预测指标，以及免疫分子机制。.重要结果与关键数据——我们研究结果显示DosR蛋白Rv1737可有效诱导M2巨噬细胞，通过产生IL-10以及诱导Th2的免疫应答，从而形成有效的结核结节，从而启动免疫保护作用。Rv2626c通过上调TGF-β的含量从而产生免疫逃避。Rv2029c和Rv2032能够被巨噬细胞的TLR2识别，继而引起促炎因子的释放。进一步研究发现DosR蛋白Rv2032是通过下调信号分子NF-κB的磷酸化水平升高，从而引起促炎因子的释放。促大肠杆菌生长曲线实验表明，Rv2029c能够增强大肠杆菌在平台期抵抗低氧应激环境的能力，由于大肠杆菌的平台期和肉芽肿的微环境相似，我们推测Rv2029c可能是通过增强结核菌最大化利用肉芽肿环境中有限氧气和营养物质的能力，从而使之存活下来，进入休眠期。由于DosR蛋白Rv2032能够产生促炎因子（TNF-α、IL-1β等），从而维护肉芽肿微环境，抑制结核菌生长。使结核菌局限于局部微环境，降低其转变为活动期的风险，因此可以作为潜伏期免疫保护候选疫苗。