基于核酸二级结构组装设计多价态的靶向HIV-1包膜蛋白gp41的新型融合抑制剂研究

The N-terminal heptad repeat (NHR) domain in HIV-1 envelop glycoprotein gp41 can fold a symmetrical triple stranded coiled-coil structure during the course of fusion between virus and target cells. Design of multivalent drug targeting to NHR triple structure can greatly improve its affinity. We put forward in this paper, based on the self-assembly and diversity of nucleic acid high structure, we can design novel multivalent HIV-1 fusion inhibitor with different structures. By designing the base composition in different and specific domains (high structure assembly domain, conjunction domain and activity domain) in one ODN, we can easily congregate multi activity domains in one assembled high structure. With the activity domains forming into active conformation (hydrophobic modified DNA helix), we get target complex structure. One of our designed multivalent molecular showed comparative activity to a marketed drug T20 in the anti-cell fusion test, and is much higher than its monovalent structure. Multivalent inhibitors of nucleic acid in this paper are unique structures to former drugs, and this strategy does not need extra chemical modification. It’s hopeful to discovery novel anti-HIV-1 fusion drug. This research may provide new strategy for designing other multivalent nucleic acid drugs.

HIV-1病毒与细胞融合过程中，其表面包膜蛋白gp41的N末端重复序列会形成一个空间上对称的螺旋三聚体。以该三聚体为靶标，设计多价药物能有效提高与靶标的亲和力。本研究全新提出，基于核酸二级结构的多样性和自组装性，设计不同价态和结构的多价类核酸融合抑制剂。通过在一条寡核苷酸序列上分区设计碱基排列（二级结构组装区、连接臂区、活性区），就可以通过核酸二级结构组装富集多个活性区，活性区进一步形成活性构象（近年新发现的含芳香基团的核酸螺旋），从而获得多价目标分子。初步研究结果提示，设计的一个多价分子表现出了与上市药物T20相当的细胞活性，远高于其单价态分子。本研究设计的多价核酸抑制剂结构完全不同于以往药物，各价态结构的实现均基于核酸二级结构组装而无需额外的化学修饰和共价连接方式，从中有望发现高活性、新结构HIV-1融合抑制剂。本研究的设计思想也将为其他核酸类药物的多价策略提供新思路和参考实例。

近些年全新发现的核酸螺旋类HIV-1融合抑制剂，主要包括基于核酸双螺旋、三螺旋、G四螺旋的三大类结构。这些分子主要通过与病毒表面包膜蛋白相互作用，抑制由蛋白介导的病毒-靶细胞膜融合过程，阻止病毒进入细胞。但是，已报道的分子活性普遍不高，IC50值大多在几百纳摩尔至几微摩尔之间。进一步展开结构设计提高活性是这类分子发展的重要方向。设计多价结构在药物化学的研究中是提高药物分子活性的一种可选择的有效策略，相较于单价分子，多价策略往往能够提高靶部位药效分子浓度，降低结合构象熵变。HIV-1跨膜亚基gp41上的NHR疏水沟槽具有空间对称分布的特征，为设计多价分子提供了可行性；此外，单个病毒表面分布有多个表面包膜蛋白，空间上最短间隔仅15nm，这也为多价分子结合提供了可行性。基于核酸高级结构的自组装特性，我们提出一种新型的多价核酸分子设计策略。在一条核酸序列上同时设计含有组装区域、连接区域和功能区域；组装区可在多条序列间形成双螺旋、四螺旋等高级结构，从而在一个分子中富集出多个功能区；功能区序列可形成活性双螺旋；最终整体组装出多价核酸分子。该方法与传统多价小分子的多价设计策略相比，无需额外化学键连，合成相对简单，且可以设计出多种结构模型。本项目研究工作中，完成了数个类型的多价模型结构的设计、合成及评价工作，并从中发现了两个具有明显活性提升的分子模型。细胞-细胞融合抑制实验显示，在一个四爪结构的模型中，多个优选的多价分子，相对于单价确实有效提高了活性，最高达42nM，比单价分子提高了20多倍。此外，圆二色谱，分析型超速离心实验、非变性凝胶电泳实验共同验证了优选分子的多价结构；表面等离子共振实验显示，多价分子相较于单价分子，与靶细胞的亲和力更强；我们还首次发现，该多价核酸分子还具有一定的逆转录酶活性。本研究从科学上完善了核酸新型多价抑制剂的设计思想，证实了针对HIV设计核酸多价抑制剂的可行性，设计的高活性多价核酸分子、以及新结构的核苷单体，为HIV-1融合抑制剂提供了新的先导结构，也为其他多价核酸分子的设计提供新思路。