基于基因组学的团头鲂铁代谢基因功能解析及其与抗病性状的相关性

Recently, great progress on genetic improvement of growth traits has been made in farmed fish, but decrease of the disease-resistant ability caused by germplasm degradation, seriously hamper the sustainable development of aquaculture industry in our country. Researches on genetic improvement of disease resistance are urgent to carry out. Iron metabolism related genes play important roles in the battle for iron between host and bacteria, while their function and correlation with disease resistance trait in fish is still unclear. Based on previous genomics data and using Megalobrama amblycephala as the research object, this project aims to identify gene structure and genetic information of the iron-related genes and clarify the relationship with their upstream and downstream genes, by bioinformatics analysis, physical and linkage map location. Using in vitro acteriostasis experiment of the recombinant proteins, excessive expression and RNA interference techniques at the cellular level, and promoter analysis to illuminate the gene function. In addition, we aim to clearify correlation between gene polymorphism and disease resistent trait by screening iron-related gene SNPs, correlation analysis and SNP verification. The results will enrich the understanding of the function of these iron metabolism related genes, help to prevent and treat bacterial haemorrhagic septicaemia, and to provide a theoretical basis for genetic improvement of disease resistance in fish.

近年来，我国养殖鱼类生长性状遗传选育工作已取得了很大的进展，但由于种质退化导致抗病能力下降，病害频发，严重阻碍着我国水产养殖业的可持续发展，有关抗病育种相关研究亟待进行。铁代谢基因在宿主与细菌的铁争夺战中起着重要作用，而对鱼类铁代谢相关基因功能及其与抗病性状的相关性尚不清楚。本项目拟以团头鲂这种对嗜水气单胞菌极为敏感的鱼类为研究对象，在前期基因组数据基础上，筛选获得铁代谢相关基因，通过对基因进行生物信息学分析、物理定位和连锁图谱定位，确定基因结构、包含的遗传信息以及与上下游基因之间的关系。利用重组蛋白体外抑菌、过量表达和RNA沉默干扰、启动子分析等手段研究基因的功能。对这些基因的SNP位点进行筛选、关联分析及验证，以明确基因多态性与团头鲂抗病性状的相关性。研究不仅将丰富对鱼类铁代谢基因功能的认识，有助于鱼类细菌性败血症的预防和治疗，并可为鱼类抗病育种提供理论依据。

近年来，鱼类抗病能力下降，病害频发，严重阻碍着我国水产养殖业的可持续发展，有关鱼类抗病育种相关研究亟待进行。鉴于铁代谢基因在宿主与细菌的铁争夺战中起着重要作用，本项目以团头鲂这种对嗜水气单胞菌（Ah）极为敏感的鱼类为研究对象，展开了铁代谢关键基因的生物信息学分析、基因功能鉴定和抗病关联分析等相关研究，结果表明这些铁代谢基因参与了机体抵抗Ah感染引起的免疫应答，和抗感染性状紧密关联，结果可为鱼类抗病育种工作提供科学数据和理论依据。本项目取得的主要结果如下：.1. 获得铁代谢关键的铁蛋白（MamFers）、转铁蛋白（MamTf）等基因，对它们进行了氨基酸序列多重比对、基因结构、系统进化、共线性等生物信息学分析。.2. 分析了目的基因在不同组织以及Ah感染后的表达模式。目的重组蛋白都具有铁结合活性和抑菌活性，目的蛋白在Ah感染后都显著上调，在细胞质或细胞核分布增多。.3. 过表达MamFers和MamTf基因后差异表达基因主要分为4类：粘附过程、免疫系统及抗菌反应、铁代谢以及转录调控；过表达能抑制Ah对EPC细胞的粘附过程，且ECM相关蛋白（FN和Intgβ1）参与了对Ah粘附过程的抑制作用。过表达MamFers和MamTf能分别诱导TNFα和iNOS基因的表达上调，且MAPK和NFκB都对此诱导表达过程发挥调控作用；能诱导NLRC5基因表达上调，并且通过NLRC5-β2M/MHC I轴，对下游铁调素（hepcidin）基因发挥调控作用。 .4. MamTf启动子区无CpG岛位点，而MamTfR启动子区有2个CpG岛位点。MamTf启动子核心区域为-268~+56 bp， -1308~-1102 bp片段可能存在正调控位点；MamTfR启动子核心区域为-224~+48 bp，且+48~+92 bp可能存在负调控元件，而-1229~-1219 bp区域可能存正调控位点。.5. 筛选出MamTf基因抗Ah感染相关的2个SNP位点，384-A/G的GG和和4029-A/C的AA基因型分别在抗病个体中占优势。筛选出MamTfR基因抗Ah感染相关的SNP位点1个，位于3837-C/T的TT基因型在抗病个体中占优势。筛选出hepcidin基因2个抗Ah感染相关的SNP位点。3371-A/G位点的基因型和等位基因频率在易感和抗病组间差异极显著，217-A/G位点的基因型和等位基因频率在