不同DYNC1H1突变体在运动与感觉神经元选择性变性中的作用

运动与感觉神经元变性存在选择性，但其分子机制尚不明确。近年研究表明，编码逆行性轴索运输的胞质动力蛋白dyneinⅠ型重链蛋白（DYNC1H1）的基因点突变小鼠Loa和Cra1与运动神经元变性有关；而将这些小鼠与运动神经元病SOD1突变小鼠杂交可显著延长后者的生存时间。而我们发现，DYNC1H1基因不同位点的缺失突变Swl小鼠仅有感觉神经元的变性；同样与SOD1突变小鼠杂交却不能延长其生存时间。Swl、Loa与Cra1均在DYNC1H1结合区域的不同位点，因此我们推测DYNC1H1结合区功能的改变可能是导致运动或感觉神经元选择性变性的关键机制。本课题通过构建含有不同Dync1h1基因突变位点的全序列质粒，拟采用基因学与蛋白组学技术探究不同DYNC1H1突变体对选择性运动和感觉神经元生存与轴索运输功能的影响，为进一步揭示dynein依赖的神经元变性病dyneinopathy的发病机制打下基础。

运动与感觉神经元变性存在选择性，但其分子机制尚不明确。前期我们与其他组研究发现，DYNC1H1的Swl突变杂合小鼠仅有早发的感觉神经元的变性；而同样基因的Loa与Cra突变有早发的感觉神经元变性与晚发的运动神经元变性。我们推测，DYNC1H1结合区功能的改变可能是导致运动或感觉神经元选择性变性的关键机制。前期已经成功构建分别带有Swl、Cra、Loa突变位点的900bp~3540bp区域碱基序列的表达质粒，通过免疫共沉淀（Co-IP）表明DYNC1H1不同突变体在293T细胞中二聚体化能力无显著性差异，可能并不是通过影响DYNC1H1二聚体化能力导致选择性神经元变性。本课题将不同质粒电转入胚胎12.5天小鼠脊髓背根神经节（DRG）与胚胎18.5天皮层运动神经元，培养48小时后观察神经元的生存数量与轴突长度。结果表明，在表达不同Dync1h1突变片段的运动神经元和感觉神经元中均出现轴突长度与存活神经元数量的差异（p<0.05）。通过在293T细胞中过表达pcDNA3.1-FLAG-Swl、-Cra、-Loa，蛋白纯化后连接于带FLAG抗体的亲和树脂上作为“诱饵”，分别与小鼠胚胎12.5天DRG细胞裂解液混合后，Co-IP后获得与不同DYNC1H1突变体结合“货物”蛋白。通过QSTAR XL串联四极杆飞行时间质谱仪检测与iTRAQ技术定量分析与鉴定具有差异表达的蛋白。初步结果显示，这些表达差异“货物”蛋白大多为线粒体功能或应激相关的蛋白。以上结果表明，不同Dync1h1基因突变对运动神经元与感觉神经元的影响是不同的，可能与线粒体或应激相关的蛋白运输障碍有关。对于不同DYNC1H1突变体在体内对运动神经元与感觉神经元功能的不同影响，我们应用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中对dync1h1基因进行定位编辑。表型鉴定提示，dync1h1杂合突变斑马鱼发育较野生型斑马鱼无明显异常；而dync1h1纯合突变斑马鱼胚胎正常形态发育受到严重抑制，脊髓肿胀，脊椎神经元数目显著减少，背部血管存在发育畸形，并于5~6dpf死亡。这为今后在体研究不同DYNC1H1突变体在神经元选择性变性机制中打下基础。