NRG1基因rs2439302C>G通过ErbB3/SOX10信号通路修饰RET基因参与先天性巨结肠症发病机制的研究

Hirschsprung's disease (HD) is a disorder of enteric nervous system development caused by polygenic inheritance. A number of studies have shown that RET is the major HD gene. HD phenotypic differences accompanied by RET incomplete penetrance prompted the existence of RET pathogenic modified genes. Recently, we found that NRG1 is an important modified RET gene. For the first time, we found that the SNP locus rs2439302C>G of NRG1 gene is closely related to the pathogenesis of HD, which further increases the risk of disease in patients with rs2435357T RET mutation locus. However, the pathogenic molecular mechanism of HD remains largely unknown. NRG1 and its receptor ErbB3 can activate the downstream PI3K / Akt signaling pathway, SOX10 plays an important role in NRG1 signaling and RET signaling in ENS development. SOX10 binds to RET gene rs2435357T and promotes RET transcription and expression. Based on this, we will investigate whether the new SNP mutation of NRG1 regulates RET protein expression through ErbB3-PI3K/Akt-SOX10 pathway and the effect of this mechanism on the migration, proliferation and differentiation of neural crest cells in vitro and in vivo, as well as role of site mutation in the molecular mechanism of HD pathogenesis. This study is of great significance for further elucidating the pathogenesis of HD and exploring alternative therapy using nerve cells.

先天性巨结肠（HD）是多基因遗传导致的肠神经发育障碍性疾病，发病机制尚未阐明。研究显示，RET是HD的主效基因，新近发现NRG1是RET重要修饰基因，我们首次发现NRG1基因SNP位点rs2439302C>G与HD发病密切相关，并进一步增加RET已知突变位点rs2435357C>T携带者致病风险，但对该位点突变在HD发病进程中的分子机制未见报道。NRG1与其受体ErbB3结合可激活下游PI3K/Akt信号通路，NRG1信号参与肠神经发育依赖SOX10实现，SOX10可与RET基因rs2435357C>T结合促进RET转录与表达。本课题拟在此基础上，观察NRG1新SNP突变是否通过ErbB3-PI3K/Akt-SOX10通路调控RET蛋白表达，及此种机制对神经嵴细胞迁移和分化影响，以揭示该位点突变在HD发病机制中的作用。对进一步阐明HD发病机制和探索神经细胞替代治疗具有重要意义。

先天性巨结肠（HSCR）作为一种先天性遗传相关的疾病，多项研究表明其发病风险与多种单核苷酸多态性 (SNP) 显著相关。 我们之前的研究表明，SNP rs2439302(NRG1) 与 rs2435357(RET) 相互作用会增加 HSCR 发病的风险，但具体分子作用机制不明。2013 年 8 月至 2018 年 6 月，470 例就诊于华中科技大学同济医学院附属协 和医院小儿外科的 HD 患儿，行 Soave/Duhamel 术时留取肠管及血液样本;同期收集非 HD 结肠造口患儿结肠 32 例作为对照。对HD 患儿 rs2439302 和 rs2435357 位点测序。免疫组织化学染色，qRT-PCR 及 Western blot 检测肠组织 中 NRG1、RET、SOX10 蛋白的表达。SH-SY5Y 细胞和诱导多能干细胞(IPSC)作为细胞层面验证模型，检测增殖，迁移，分化能力差异，并在斑马鱼动物模型中验证。我们在 HSCR 患者和具有 rs2439302 GG/rs2435357 TT 基因型的 SHSY-5Y 细胞的神经节细胞节段中发现 NRG1 和 RET 表达下调。 在斑马鱼中，与 NRG1 单突变体或 RET 单突变体相比，NRG1 和 RET 双突变体引起的肠神经元数量减少最严重，rs2439302 GG/rs2435357 TT 基因型的 SHSY-5Y 细胞和 IPSC 表现出增殖、迁移和分化能力降低。 CTCF 对 SNP rs2439302 CC 的结合能力显著高于 GG 基因型。 NRG1 减少通过影响 PI3K/Akt 通路导致 SOX10 表达降低，进一步通过rs2435357来调节 RET 表达。