先天性巨结肠症肠道菌群对Neuroligin基因的作用机制研究

Although Hirschsprung's disease (HSCR) is a common disease in pediatric surgery,it still unable to fully explain the pathogenesis, and therefore leading to the difficulties in diagnosis and treatment. Our prior study found that the revelation of the extracellular matrix fibronectin and neuroligin gene is closely related to the combined results of "gene abnormalities" and " microenvironment changes" theories. Due to the data, we found that inflammatory factors played a key role in the progress of synaptic mature and neuroendocrine function by the regulation of neuroligin gene and are closely related to the intestinal flora abnormalities. So the proposed the theory that intestinal bacteria effected the inflammatory microenvironment to regulate neuroligin gene, which was investigated by the immunohistochemistry, PCR, stem cell isolation, virus transfection and apoptosis in vivo, in vitro and in surgery colon tissues. The results will reveal the relationship between intestinal flora abnormalities and inflammatory microenvironment, and the molecular mechanism in the regulation of neuroligin gene in the pathogenesis of HSCR. We also provide a theoretical basis for the application of early diagnosis of HSCR and the application of microbial mechanisms in HSCR treatment. Changes in the inflammatory environment of the intestinal nervous system provide a new perspective for clinical work.

先天性巨结肠症(HSCR)是小儿外科常见病，因其发病机制不明确，导致诊疗的困难。我们前期研究发现细胞外基质fibronectin与neuroligin基因的调控密切相关，证实HSCR的发病机制是“基因异常”和“肠壁微环境变化”共同作用的结果。预实验发现对肠神经系统突触发生、成熟和功能起重要作用的neuroligin基因和炎症因子的表达密切相关，而肠道菌群异常可能是导致炎症环境的诱因之一。于是提出肠道菌群通过影响炎症微环境进而调控neuroligin基因这一假说，并采用免疫组化、PCR、干细胞分离培养、病毒转染、细胞凋亡等技术在人体标本，动物模型和细胞实验三个层面探讨肠道菌群与炎症微环境的关系及对neuroligin基因的影响，为HSCR早期诊断指标的探索及微生物在其治疗中的应用提供理论依据，从新视角揭示HSCR的发病机制，为临床工作提供新思路。

研究背景：肠神经发育不良（IND）及先天性巨结肠（HSCR）同属于肠神经发育异常性疾病，在临床上以顽固性便秘甚至肠梗阻为主要表现。肠神经胶质细胞（EGCs）在结肠动力性疾病中的作用逐渐得到认识，但EGCs在HSCR不同病变节段中与肠神经元（ENCs）发育分布关系有待进一步明确；同时，探索IND的发病机制，了解 ENS发生发育过程中与肠道菌群之间相互作用，有助于探究IND新的诊疗及防治手段。.研究内容：研究EGCs对常见致病菌抗原物质SEA的反应特性，以及动物双歧杆菌通过EGCs改善IND模型小鼠结肠动力中的作用机制；对HSCR病变肠管各节段中的标志物GFAP及S100β进行检测，评估EGCs在HSCR肠管中的分布和发育，了解病变肠段中EGCs与ENCs的位置关系是否存在相关性。.主要研究结果：.1. 细菌毒素SEA能以剂量和时间依赖性方式引起EGCs细胞病变效应，并促使EGCs在一定承受范围内产生“活化状态”并产生GDNF帮助抵御外来抗原，进而对ENCs产生保护作用；.2. 双歧杆菌可能通过EGCs的GDNF-GFRα通路激活过程并使之产生神经营养因子，对IND动物模型的症状及结肠动力有改善作用；.3. HSCR的病变肠管中，EGCs的发育及分布与ENCs呈现一致性，GFAP及S100β在四部分病变肠管中呈现逐渐变化的趋势，无神经节肠段肌间EGCs存在明显的数量减少及发育异常。.研究创新性及科学意义：.1. 通过活菌培养的方法，而非使用商品化益生菌对IND模型敲基因小鼠进行肠道菌群干预，产生了可见的治疗效果，预示了先天性肠神经发育疾病中肠道菌群活菌移植疗法的可行性，证实了EGCs通过 GDNF-GFRα通路的激活在与菌群的相互作用中产生积极效应，也为我们下一步的研究指明了方向；.2. 通过对病变结肠段肌层中EGCs发育情况的研究，证实EGCs在病变肠管近端段到无神经节段存在逐渐减少的趋势，结合ENCs标志物HuC/HuD显示肌间神经节与EGCs的位置关系，发现EGCs的变化趋势对病变节段也有很好的指示作用。