先天性巨结肠症未知易感及免疫缺陷相关基因的探寻

Hirschsprung disease(HD) is a common neurocristopathy thought to be controled by the interaction of multiple genes with the complicated genetic mechanism. By using molecular genetic analysis to date, a minimum of 11 neuro-developmental genes are known to harbor high-penetrance mutations that confer a large risk to the bearer. But the vast majority (about 80%) of HD heritability is still hidden or missing.So it is interesting for molecular geneticists to define the susceptible genes of HD that remain unknown. QTL(quantitative trait locus) analysis is a effective method to define the genetic mechanism of complicated diseases.By producing the congenic strain with the Ednrb mutation, we found that the genetic background strongly modified the phenotype of HD, which suggested that the genetic factor(s) in changed genetic backgrounds interact(s) with Ednrb gene to affect the symptom of HD. In addition, we found that Ednrb mutation resulted in the immunodeficiency in the AGH rat strain also modified by genetic backgrounds.To define the unknown genes, we prepare to perform the QTL analysis by using these strains with the distinct phenotype difference to produce F2 generation and DNA microarray that shows the difference of gene expression. This study will provide the important information for analysising the genetic mechanism of HD and HD-associated immunodeficiency.

先天性巨结肠症是一种常见先天性肠神经系统发育障碍。其遗传机理复杂，被认为由多基因互作控制。迄今为止，分子遗传学的研究已揭示了11个高外显率的致病基因,仍有80%的病例遗传原因未知，因此利用各种遗传分析方法确定此类疾病未知易感基因一直是分子遗传学研究的一个方向。QTL分析是复杂疾病遗传解析的一个有效手段。我们利用携带内皮素受体基因突变的大鼠模型制作了遗传背景置换的导入系，发现遗传背景巨大地修饰巨结肠症表型，指示遗传背景中可能存在未知易感基因与内皮素受体基因互动修饰巨结肠症表型。另外，我们还发现内皮素受体基因突变也导致免疫缺陷的性状，同样显著地受遗传背景修饰。因此，为确定这些未知的修饰基因，我们准备利用这些存在巨大系统差的鼠系生产F2代，在F2代中进行QTL分析结合基因表达阵列确定这些未知的基因，为全面阐明先天性巨结肠症病及相关免疫缺陷的遗传机理提供强有力的信息。

先天性巨结肠症(Hirschsprung disease, HSCR)是一种可遗传的新生儿常见肠道发育异常疾病。已鉴定的易感基因只能解释少部分病例，其发病机制尚未完全解明。另外，部分巨结肠症病人伴随色素异常，其调控机制还不清楚。. 本研究以HSCR大鼠模型为研究对象，利用全基因组QTL定位、生物信息学分析、PCR-测序、双荧光素酶报告基因检测系统、CRISPR/Cas9基因编辑等技术，对HSCR及色素异常相关QTL进行定位，在其95%置信区域筛选可能的HSCR及色素异常相关基因，通过对候选基因进行测序分析来寻找在两个大鼠品系基因组中存在的差异，并对差异进行功能性研究，进一步分析其修饰HSCR及色素异常表型的机理。本研究主要得到以下结果：.（1）AGH-Ednrbsl/sl大鼠肠神经细胞缺损严重，LEH-Ednrbsl/sl症状较轻，利用其F2代在大鼠Chr 2上D2Mgh14位点附近定位到一个与HSCR显著相关的QTL位点，最高LRS值（D2Mgh14）达25.0，该位点造成的变异占总变异的15%。.（2）在Chr 2上的HSCR相关QTL置信区间内筛选出三个HSCR相关候选基因：Slc45a2、Gdnf和Ptger4。测序发现Gdnf基因第一起始密码子上第613位碱基处存在一个C/T突变（g.76896910 C>T），其中，LEH群体为C，AGH群体为T。双荧光素酶报告基因检测系统检测后发现该突变位点使得AGH群体中Gdnf表达量大大降低。.（3）AGH-Ednrbsl/sl大鼠毛色几乎全白，LEH-Ednrbsl/sl头部有较大一块着色，利用其F2代在大鼠Chr 7上D7Got23位点附近定位到一个与色素异常极显著相关的QTL位点，最高LRS值（D7Got23）为45.0，该位点造成的变异占总变异的26%，在大鼠Chr 7上色素异常相关QTL置信区间内筛选得到3个候选基因：Lgr5、Wif1和Kitlg基因。其中，在AGH品系和LEH品系的Lgr5和Wif1基因外显子区及上游部分启动子区未找到突变；而在Kitlg基因编码区检测到一个错义突变（g.42338824 C＞T），该突变造成对应氨基酸由脯氨酸变成丝氨酸。在SITF线上软件预测该突变可能影响其蛋白质功能。