表观遗传学修饰诱导炎性Treg分化并参与胆道闭锁发病的作用及其机制

Progressive autoimmune injury of bile duct was considered to be vital pathogenesis of biliary atreia (BA). Previous study of our group found massive infiltration of Foxp3+Treg in intrahepatic bile duct microenvironment in BA. Interestingly, these Foxp3+Tregs proved to be heterogeneous, containing a subset of pro-inflammatory IL-17+FoxP3+Treg. Recent reports suggest epigenetic modification of Foxp3 plays a vital role in the differentiation and function of Foxp3+Treg. Thus we inferred that the variation of microenvironment cytokines, such as TGF-β and IL-6, could promote epigenetic modification of FoxP3/ROR-γt gene, inducing IL-17+FoxP3+Treg differentiation, which secreted IL-17 and mediate bile duct injury. This research is to detect: different cytokines in hepatic microenvironment, DNA methylation and histone acetylation of FoxP3 and ROR-γt promotors genes, the FoxP3 and ROR-γt related protein expressions, and the number of IL-17+FoxP3+Tregs; to build BA animal models, observe the dynamic changes of cytokines and the above variables. The project is expected to investigate how hepatic microenvironment cytokines regulate differentiation of inflammatory Treg subsets through epigenic modification of FoxP3/ROR-γt, and how it contributes to the pathogenesis of BA.

自身免疫反应所致胆管进行性炎性损伤是胆道闭锁（BA）重要发病机制。项目组前期发现BA汇管区有大量FoxP3+Treg浸润，其具有异质性，包含有致炎效应的IL-17+FoxP3+Treg亚群。文献报道，表观遗传学修饰是调控FoxP3表达的重要机制。申报者据此推测，BA汇管区细胞因子（TGF-β、IL-6等）消长可通过表观遗传学机制调控T细胞FoxP3/ROR-γt基因表达，诱导IL-17+FoxP3+Treg分化并分泌IL-17，从而介导胆管损伤。本项目将检测BA患儿肝微环境细胞因子水平、FoxP3/ROR-γt基因启动子区DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态、蛋白表达水平、IL-17+FoxP3+Treg数量；建立BA模型，在疾病不同阶段动态观察肝微环境上述指标的改变。从而阐明肝微环境通过表观遗传学修饰调控炎性Treg亚群分化并参与BA发病的作用及机制，并为临床探索干预BA的新策略提供实验依据.

研究证实多种免疫细胞参与了轮状病毒（RRV）感染诱导的BA小鼠模型的胆管免疫炎性反应，其中Treg细胞在BA疾病环境中抑制炎症功能失常可能在该疾病发生发展中起到重要作用。为了探究Treg细胞功能失常的机制，本课题组通过结合重亚硫酸盐的测序法（BSP），发现在动物和人体内Treg细胞的特征性转录因子Foxp3基因的甲基化程度是上升的（人：62.75±5.45% vs 5.379 ± 2.43%；小鼠：注射RRV后第四天54.84 ± 6.64% vs. 11.11±0.40%，注射RRV后第七天64.94±9.04% vs. 12.92±0.72%,注射RRV后第十一天44.99±5.34% vs. 9.07±0.91%），而且，通过注射5-aza-2’-氮杂胞苷（Aza），实验组小鼠的BA症状减轻，包括体重增加，皮肤黄疸及陶土色大便发生率下降，生存率上升。通过提取Aza干预的BA小鼠体内的Treg细胞，发现其在体内和体外抑制炎症的功能较BA小鼠中提取的Treg细胞要强。因此我们认为，Foxp3基因启动子甲基化程度异常增高，可能导致Treg细胞抑制炎症功能受损，进而加重BA的炎性损伤。本研究为探讨BA中肝脏进行性炎症损伤的机制提供了坚实的工作基础，同时对于认知表观遗传学，以及表观遗传学调控在BA免疫损伤中的作用提供了重要的的启示性线索，并对将来免疫治疗BA提供相应理论基础。项目资助发表SCI论文3篇，核心论文3篇。培养博士研究生7名，其中4名已取得博士学位，3名在读。培养硕士研究生6名，其中3名已取得硕士学位。同时，项目负责人的研究成果收到省级专家的肯定，并于2015年获湖北省科学技术奖二等奖。项目投入经费65万元，支出33.2万元，各项支出基本与预算相符。剩余经费31.8万元，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。