枯草芽孢杆菌胍基核糖开关RNA调控基因表达的动态结构基础

Riboswitches are capable of regulate gene expression in microbe. During regulation of gene expression, guanidine riboswitch (fl-riboG), containing aptamer domain and expression platform, binds to guanidine specifically, triggering conformation switches and regulating the gene expression for guanidine carboxylase and efflux pump protein, SMG to control mass balance between the inside and outside of a cell. Up to know, only the crystal structure of the aptamer domain of fl-riboG has been reported. The mechanism of gene regulation for fl-riboG remains to be elusive because of missing the structures of the RNA solely and the complex of fl-riboG with guanidine. We developed the PLOR method and capable of introducing various groups, including isotope、heavy-atom、fluorophore into selective positions to facilitate the structural and functional studies for non-coding RNAs. Here we plan to apply PLOR、NMR、crystallography and stopped-flow fluorescence to obtain multiple conformations and dynamic switches of the guanidine riboswitch from Bacillus subtilis. The project will clarify the structural basis for exploring the dynamic processes of fl-riboG during gene regulation. Our study is potentially important for mechanism study of riboswitches and developing new drugs.

核糖开关RNA是微生物中重要的基因表达调控元件。胍基核糖开关RNA（fl-riboG）包含适体域和表达平台，通过结合胍基改变构象，调控细菌内胍基羧化酶和外排泵SMG蛋白的基因表达，维持微生物细胞内外物质平衡。迄今已报道了适体域的晶体结构，尚未报道表达平台及fl-riboG与胍基复合物的结构，尚不清楚fl-riboG调控基因表达的分子机制。申请者曾参与研发PLOR方法，合成在特定位点上含有同位素、重元素、荧光团修饰（标记）的非编码RNA，用于结构和功能研究。本项目拟在前期工作基础上，结合PLOR、NMR、X-射线衍射、停-流荧光动力学等方法，获取枯草芽孢杆菌fl-riboG结合配体过程中存在的多种动态构象以及构象之间的转变，揭示fl-riboG结合配体改变构象的分子机制。研究结果将为深入理解核糖开关RNA调控基因表达的功能提供结构基础，并为靶向药物设计提供理论依据。

核糖开关RNA具有重要的生物功能，能通过与配体结合改变自身结构，进而调控下游基因表达。但目前对全长核糖开关RNA的动态结构研究十分有限，导致其调控基因表达的分子机制仍不清楚。在本项目的资助下，申请者以胍基核糖开关RNA为主要研究对象，探索其动态结构与基因调控的分子机制。我们通过对不同RNA的序列进行测试，优化PLOR方法（Position-selective Labelling of RNA），成功实现高效地将包括荧光团（Cy3、Cy5）、同位素（13C、15N）和重原子（Br）引入到胍基核糖开关RNA的指定位点上，追踪该RNA的适配体（riboG-apt）、转录终止域（riboG-term）以及全长RNA（fl-riboG）响应Mg2+以及配体所引起的动态结构和基因调控的改变。实验结果表明，胍基核糖开关RNA的这些关键结构域均存在多种结构共存，但它们对Mg2+与配体的响应存在着显著差异。在生理浓度的Mg2+下，胍基核糖开关RNA对胍基的响应灵敏度与RNA长度成正相关，并且fl-riboG在构象种类以及构象之间的转变频率都高于riboG-apt和riboG-term。结构上的差异也导致胍基核糖开关RNA在不同长度下调控基因表达的能力不同，例如在2 mM Mg2+时，riboG-apt即使在5 mM 胍基下，仍无法高效调控基因表达；而riboG-term和fl-riboG在1 mM 胍基下，就可导致超过50%的下游基因被沉默。我们因此展开了转录共折叠来研究胍基核糖开关RNA的长度与动态结构和调控机制的关联，搭建了转录共折叠响应配体的动态结构模型。我们的研究揭示了胍基核糖开关RNA以及与其关键结构域相近的腺嘌呤核糖开关RNA在内的全长核糖开关RNA在结合配体、转录过程中的动态结构转变，加深我们对核糖开关调控基因表达分子机制的理解，为以核糖开关RNA为基础的靶向药物和新型分子传感器的研发提供重要的结构基础。