枯草芽孢杆菌纤维素酶系表达系统的构建

纤维素是世界上最丰富的可再生资源，纤维素酶就是将纤维素分解为单糖的一组酶，称之为纤维素酶系。为缓解饲料原料的紧张提高粗饲料利用率，本项目拟采用分子生物学和基因工程的方法，以纤维素酶系的三个基因为外源基因，构建整合表达载体，经过连接排列，使这三个基因通过双交叉整合重组到益生菌枯草芽孢杆菌宿主基因组中；构建枯草芽孢杆菌纤维素酶系基因重组菌，使外源纤维素酶基因能够在宿主菌中表达；以cre-LoxP系统作为辅助载体删除重组菌的抗生素抗性基因，使重组菌达到食品级。将重组菌饲喂动物，测定动物生长性能，饲料粗纤维的消化率，免疫性能的变化等。通过上述方法，拟获得的结果为：构建纤维素酶系基因高效表达载体，通过电击整合到宿主枯草芽孢杆菌中并表达，构建无抗性标记枯草芽孢杆菌纤维素酶系基因重组菌；对重组菌理化性质进行研究；重组菌饲喂动物能够对动物生长性能、粗纤维消化率和免疫性能产生积极的影响。

通过广泛筛选获得了产纤维素酶的细菌、放线菌和霉菌，设计不同类型的引物扩增到了纤维素酶系不同类型的基因，通过测序和比对，对纤维素酶基因做了详细的序列分析。根据枯草芽孢杆菌168基因组序列信息，扩增了同源重组的同源片段，兵扩增了P43启动子片段，根据这些元件，构建了枯草芽孢杆菌整合表达的载体，并通过双交叉同源重组将纤维素酶系的基因整合到表达载体上进行表达研究。通过实时定量和SDS-PAGE电泳检测三个基因在重组菌种中的表达情况，结果显示三个基因均在重组菌种得到了不同程度的表达。重组枯草芽孢杆菌纤维素酶活力较野生型菌种的纤维素酶酶活力提高1倍。将重组枯草芽孢杆菌添加到雏鸡日粮中进行饲养试验，结果表明试验组雏鸡较对照组1-30日龄增重差异显著（P＜0.05），试验组粗纤维消化率较对照组差异显著（P＜0.05）。说明重组枯草芽孢杆菌可以提高日粮粗纤维消化率，促进雏鸡生长。