基于宏转录技术对活性污泥在适应印染废水过程中微生物种群结构和功能活性的演变机制研究

本项目拟利用16S和26S rRNA基因的PCR-克隆、序列分析、DGGE微生物群落分析、FISH等技术构建印染废水活性污泥体系中细菌、古菌和真菌的种群克隆文库，全面分析来源于城市污水处理厂的活性污泥种源在实际印染废水生物处理系统构建和稳定过程中微生物群落组成的演变规律；利用最新的宏转录技术构建活性污泥体系的功能基因文库，研究活性污泥中微生物群落的功能活性，比较活性污泥在适应印染废水前后的功能变化，阐明微生物种群与功能的关系；通过设计高通量筛选培养基的方法，对染料降解相关基因进行筛选和确定，初步阐明染料在废水处理系统的生物降解机制，并在可能的情况下争取发现新的染料降解基因。

本项目首先利用分子生物学手段研究了在摇瓶培养条件下，取自城市污水处理厂的活性污泥在实际造纸和印染废水中驯化及适应过程中微生物群落变化规律，发现细菌和原生动物是最敏感的类群，其种类和数量都发生了巨大变化，真菌数量基本恒定。虽然工业废水驯化过程明显影响细菌的群落结构和组成，使细菌的优势类群在各分类水平上向着更单一的方向进化，但驯化末期三种系统中优势微生物在刚和亚刚水平上相似，一些微生物种属一直存在于所有的系统中。在对多个样品的454高通量测序研究中发现，真菌的类群非常单一，并且没有检测到酵母菌，但是利用针对于酵母菌的PCR-DGGE分析和酵母菌的分离培养鉴定等手段对印染、造纸、发酵、制药和城市污水处理系统中酵母菌生态分布研究，发现所有污水处理系统中都有酵母菌存在，至少分布在32个属51个种，种属分布与污水水质和工艺相关。污水处理系统中酵母菌种类超过了通常人们认为的高含糖土壤中的类群。对分离培养获得的257株酵母菌进行产胞外酶研究，发现所有的酵母菌都不能产生纤维素酶、淀粉酶、植酸酶，大多数都能够对多种染料进行脱色，获得了多株能产生蛋白酶、脂肪酶、锰依赖过氧化物酶、木质素过氧化物酶的菌株。基于此，分离筛选和配伍了一组以真菌为主的能对多种难降解物质降解的混合微生物菌剂，建立了实验室规模的真菌负载活性炭连续运行装置，对造纸和印染废水进行深度处理，取得了很好的处理效果，添加菌剂的反应器比对照在COD去除和色度去除等方面具有明显优势；利用分子生物学技术对真菌负载活性炭反应器在处理印染和造纸废水过程中微生物群落结构和组成、功能基因的丰度和多样性的变化、功能微生物类群的动力学变化等进行了追踪研究，发现添加的微生物菌剂会在1个月之后数量有所减少，需要补充，但运行三个月后总体仍高于对照反应器。基于所获得的菌剂和深度处理技术，设计和构建了包含二级生物处理系统的日处理1000吨印染废水的处理系统，在系统构建、调试和运行过程中，利用PCR-DGGE、T-RFLP、454-高通量测序等技术进行了细菌、真菌、古菌这三大类微生物的全面追踪和剖析，系统研究了微生物群落组成和结构的动力学变化过程，发现系统构建过程中微生物群落发生了巨大变化，并且随着废水水质的变化，这种进化在一直进行着，添加的真菌混合菌剂可以在系统中长期存在，古菌的比例逐渐升高，特别是在第二级生化处理系统中，推测可能与难降解物质的降解有关。