畜禽粪便中多重抗生素抗性细菌和抗药基因在土壤蔬菜中的传播和机制研究

Spreading multiple antibiotic resistance from livestock manure to environments has been aroused great attention. In this project application, 3-5 chicken and pig farms, manured soil, various vegetables including leaf vegetables, fruit vegetables and rootstalk- like vegetables will be selected to investigate the mechanism and risk of antibiotic resistance transmission from manure to soil and vegetables by using cultivation, gene chips, real time PCR, meta-transcription and pyrosequencing techniques. The main multiresistance microbial population and resistance gene types as well as their roles and weights in antibiotic resistance transmission process will be evaluated in detail. The relations of structure-effects and dosage-effects between multiple antibiotics exposure and the occurrence of resistance population and genes will be clarified through lab-scale simulated tests. The possible route of horizontal transfer of resistance genes will be determined by investigating the transposable elements in cultivable microorganisms and the location relationship between the resistance genes and those elements. The mechanisms for horizontal transfer of resistance genes in manure, manured soil and vegetables are hopeful to be elucidated through qualititively and quantitively investigating these gene transposable elements in such habitats.

通过畜禽粪便向环境传播多重抗生素抗性已经引起人们的高度关注。本项目拟分别选择3-5个养鸡场和养猪场，选择施用养殖粪肥的土壤以及叶菜类、果蔬类和根茎类蔬菜，通过培养、基因芯片技术、定量PCR技术、宏转录和高通量测序等方法研究抗生素抗性，特别是多重抗生素抗性通过畜禽养殖粪便向施肥土壤和施肥蔬菜的表面以及内生菌系统中进行传播的风险和机制，阐明传播多重抗性的微生物类群和主要抗药基因类型，阐明在粪便、施肥土壤、施肥蔬菜中抗性微生物种群和抗性基因在抗性传播中的作用和比重；通过实验室模拟实验研究不同剂量的多重抗生素联合暴露与抗生素抗性菌群和抗药基因产生之间的构效和剂量关系；通过研究分离培养的多重抗性微生物菌株中主要的可移动元件类型以及抗药基因与可移动元件的定位关系来确定抗性基因水平转移的可能途径，并通过对粪便、土壤和蔬菜中基因可移动元件的定性定量研究，阐明抗药基因在这些生境中的水平转移机制。

畜禽养殖过程中抗生素的滥用导致大量耐药微生物的产生并随畜禽粪便施肥过程向土壤环境的传播已经引起高度关注。本研究针在该过程中对多重耐药细菌的产生和传播机制开展了一系列研究，获得如下创新性结果：（1）畜禽粪便、施肥土壤中抗生素残留、多重耐药细菌的比例都明显高于未施肥土壤；基因芯片检测表明，土壤中耐药基因数达5千多种，远高于畜禽粪便；而基因定量结果表明，在鸡粪中氨基糖苷类耐药基因富集最高，达7万多倍，猪粪中四环素类耐药基因富集高达130万倍；（2）通过大田检测和实验室盆栽实验证明，施加抗生素和畜禽粪便的土壤和蔬菜内生菌系统中抗生素残留、多重耐药细菌和耐药基因含量都较对照高，说明抗生素污染和暴露能够明显提高环境和蔬菜内生菌系统中的耐药性；畜禽粪便中只有个别多重耐药细菌可以在土壤中的存活，但是蔬菜内生菌中的多重耐药细菌种类与土壤中多重耐药菌类群完全不相同，说明土壤中的耐药细菌不能直接进入蔬菜存活；（3）鸡粪和猪粪经过简单好氧堆肥60天能够大大削减抗生素残留量、多重耐药细菌和总细菌的数量以及耐药基因的丰度，但是多重耐药细菌的比例升高，大多数耐药基因仍能检出，堆肥时间很重要，至少需要60天；（4）从畜禽粪便中分离到94株多重耐药细菌，它们都含有不止一个质粒，耐药基因、1类整合子和2类整合子以及由它们携带的多至四、五个耐药基因的基因盒在质粒和染色体上都广泛分布，质粒上多于染色体上；可移动元件携带着耐药基因在细菌细胞内质粒和染色体之间、以及不同种属的细菌之间可以很容易共同传播；（5）污水处理厂和畜禽粪便中的多重耐药细菌的类群、质粒、耐药基因盒的多样性都明显高于医院废水，说明畜禽粪便和污水处理厂是耐药扩散、富集的根源；常规污水处理过程不能消除耐药，反而进一步富集，特别在剩余污泥中；（6）从多重耐药细菌中分离了多个质粒并进行了测序；初步研究了多重耐药质粒在不同抗生素和重金属暴露下向其他种属细菌自然转化的特点。