OPNr-PIK3CD通路调节AECOPD气道上皮细胞炎症和重塑的特异性作用和分子机制

Acute exacerbation of chornic obstructive pulmonary disease (AECOPD) worsens disease phenotypes, lung tissue inflammation, injury, and remodeling. We found increased levels of osteopontins (OPN) were closely correlated with severity and dynamic changes of AECOPD as well as the improvement of patient symptoms, on basis of our previous study on plasma protemics and monocyte geneomics of patients with AECOPD. The present study aims at further investigating regulatory effects of OPN subtype (OPNr) in inflammation and remodeling of human airway epithelial cells, gene and protein expression or specificity of OPNr in primary epithelial cells harvested from patients with AECOPD. Our previsou study also demonstrated that PIK3 played important roles in OPN-regulated inflammation of airway epithelial cells. Using self-assembled cell microarray with about 700 kinase siRNA in the present study, we will mapkinase gene expression during OPNr regulation and define the special role of OPNr-PIK3CD pathway among kinases. In AECOPD-mimiced cell and animal models, we will explore regulatory roels of OPNr-PIK3CD pathway in gene and protein expression and production, epithelial inflammation, and tissue remodeling afer challenges with LPS or OPNr. From aspects of OPNr expression, distribution, and function, we will validate specific effects of selected target subtypes in the development of AECOPD and mechanisms by which OPNr-PIK3CD pathway regulates lung tissue inflammation, injury and remodeling during AECOPD, in order to provide solid evidence and practical values of OPNr as a new biomarker in diagnosis and therapy of AECOPD.

慢性阻塞性肺病急性加重期（AECOPD）是导致慢阻肺持续反复加重的主要原因。课题组前期在慢阻肺基因组和蛋白组研究中发现骨桥蛋白(OPN)升高与病程和发展、症状改善密切相关。磷脂酰肌醇激酶3（PIK3）在OPN调节上皮细胞炎症中起重要作用。为进一步研究AECOPD发生发展的分子机理，将研究OPN亚型（OPNr）- PIK3亚型（PIK3CD）调节人气道上皮细胞在AECOPD炎症和重塑的作用和疾病特异性。本课题将用含700激酶基因siRNA的自装细胞芯片测量OPNr调节激酶基因组学表达和细胞重塑，明确OPNr-PIK3CD在疾病中的关键调控作用。用AECOPD细胞和动物模型明确OPNr-PIK3CD对炎症（LPS）或OPNr诱导的上皮细胞OPNr产生、炎性反应和气道重塑的调控机理。通过阐述OPNr-PIK3CD在AECOPD发展中作用和分子机制，为AECOPD诊治提供理论依据和新的生物标记物。

背景.吸烟是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的主要危险因素之一，气道上皮细胞作为肺抵御香烟烟雾损伤的第一道防线，启动防御机制，但其分子机制尚不清楚。OPN在慢阻肺中高表达，在肺上皮细胞炎症和损伤中发挥重要作用，但其机制尚不清楚。本研究旨在探讨慢阻肺中骨桥蛋白（OPN）调节肺上皮源性炎症的潜在机制。.方法.首先我们通过生物信息学、细胞和动物中的基因修饰以及外部OPN蛋白来评估OPN疾病特异性和上皮炎症。结合已有实验室方法提取了烟雾提取物 CSE。用siRNA方法下调OPN基因表达，用外源性OPN细胞因子刺激，并用CCK-8方法检测16-HBE细胞的炎症和增殖情况。构建COPD小鼠模型，构建SPP1基因肺部特异性敲除和全身敲除小鼠，用以研究 OPN在吸烟引发的COPD小鼠肺部炎症中是否起关键作用, 并用 RT-PCR检测OPN及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）亚型的基因表达情况。进一步通过使用相应抑制剂抑制PI3K亚型和ERK信号通路，通过mRNA表达评估信号通路的参与情况。特络细胞是一种新型间质细胞，有研究表明其参与急性肺损伤修复，但尚无特络细胞参与慢性肺部炎症的相关研究。我们用空间转录组学的方法揭示OPN和OPN阳性上皮细胞亚型和特络细胞的空间和分布。用OPN单克隆抗体及OPN的小分子干扰物分别阻断 OPN的表达，共培养法测定肺上皮细胞和特络细胞之间的相互作用。.结果.我们发现吸烟者、患有COPD的吸烟者以及患有COPD和癌症的吸烟人OPN表达增加。在基因组或肺部OPN条件性敲除小鼠中，CSE诱导的肺部炎症和损伤减少。上皮内OPN基因或外部蛋白与PI3K I类成分发出强烈信号，如CSE诱导的上皮源性炎症中的催化部分（PIK3CA/p110α、PIK3CB/p110β、PIK3CD/p110δ、PIK3CG/p110γ）和调节部分（PIK2R1、PIK3R2、PIK3R3）。OPN和OPN阳性上皮亚型的空间位置表明，气道上皮细胞是高度相关的特络细胞。上皮性OPN调节上皮细胞与上皮细胞和特络细胞的通讯。.结论.研究结果表明，细胞内和分泌的OPN调节COPD肺上皮起源的炎症和上皮主导的细胞间通讯。因此，局部上皮OPN的稳定可能是预防和治疗COPD上皮源性炎症和肺损伤的替代方法。