microRNA-126在胰岛素抵抗发生中的作用和机制

Insulin resistance is throughout the whole process of type 2 diabetes, and the role of miRNA on insulin resistance is still not clear. In the previous study, we found that overexpression of miR-126 in beta cells could significantly inhibit the expression of IRS-1, PI3K, and Akt protein, which are involved in insulin signaling pathways. These results indicate that miR-126 may involve in insulin resistance by this pathway. In the preset study, we will measure the expression of miR-126 and its target gene in isolated Zuker rat islets. After interfering the expression of the miR-126 by miR-126 mimics or inhibitors, we measure oxidative stress related proteins, the mitochondrial membrane potential, inner cell calcium concentration, cell proliferation, cell apoptosis and active oxygen by using the quantitative PCR, Western Blot, flow cytometry, the confocal laser scanning microscopy and patch clamp technology. After regulation the expression of miR-126 in Zuker islet, peripheral blood insulin and blood sugar level will be measured. We want to clarify the role of miR-126 on insulin resistance and provide the new experimental basis and preventive targets for type 2 diabetes.

胰岛素抵抗贯穿于2型糖尿病的整个过程，miRNA在胰岛素抵抗中的作用机制尚不明确。本课题组前期研究发现：过表达miR-126能显著抑制β细胞胰岛素信号通路IRS-1、PI3K及Akt蛋白的表达，提示miR-126可能通过以上通路参与胰岛素抵抗。本课题拟在分离纯化Zuker大鼠胰岛细胞，检测miR-126及靶基因的表达；利用miR-126模拟物或抑制物干预胰岛细胞miR-126的表达后，采用定量PCR、Western Blot、流式细胞术、激光扫描共聚焦显微镜及膜片钳等技术检测氧化应激相关蛋白、线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度、细胞增殖凋亡及活性氧簇等指标的变化；通过在体调控Zuker大鼠胰岛miR-126的表达，检测大鼠外周血胰岛素及血糖水平变化，以期进一步阐明miR-126在胰岛素抵抗中的作用与机制，为2型糖尿病的防治提供新的实验依据和防治靶点。

目前认为Ⅱ型糖尿病发病的主要原因是胰岛素抵抗，胰岛素抵抗与氧化应激、激素因子、炎症反应及内质网应激等共同作用有关，但胰岛素抵抗的确切机制尚未完全阐明。本课题在SD大鼠胰岛β细胞以及大鼠胰岛瘤细胞INS-1等细胞，研究了microRNA-126(miR-126)在胰岛素抵抗发生发展过程中的作用与机制。本工作应用合成的miR-126拟似物miR-126mimic和miR-126抑制物miR-126inhibitor转染INS-1及原代的大鼠胰岛细胞， 利用实时定量Q-PCR、Western Blot技术观察了胰岛素抵抗信号通路中IRS/PI3K/Akt/mTOR等信号分子变化；应用双荧光素酶报告基因法检测miRNA-126对IRS-2的表达调控作用；在INS-1细胞模型上利用膜片钳技术，研究miRNA-126对INS-1细胞钙通道电流、钙离子浓度及胰岛素分泌量的影响；电子显微镜下观察细胞超微结构等形态变化；以及miR-126对INS-1细胞的增殖和凋亡的影响。结果显示： miRNA-126-3p不仅能够靶向抑制INS-1细胞胰岛素受体底物IRS1与IRS2蛋白的表达，而且可以抑制原代大鼠胰岛β细胞中IRS-1与IRS-2的表达。miR-126抑制IRS2蛋白表达的作用强于抑制IRS1的表达，并通过改变细胞内IRS1与IRS2的比例与平衡实现抑制INS-1细胞的增殖。在基础糖刺激下miR-126mimic可以增加INS-1细胞的胰岛素分泌量，而miR-126inhibitor减少INS-1细胞的胰岛素分泌量。在INS-1细胞中，过表达miR-126可减少XIAP表达，促进caspase-3活化(降低pro-caspase-3水平)，增加Omi/HtrA2的表达，诱导INS－1细胞凋亡。电镜下可见miＲ-126mimic 组INS-1细胞，细胞核呈折缝样改变，染色质高度浓缩、边集，凋亡增多。INS-1细胞过表达miRNA-126出现钙离子内流增多，细胞内钙离子浓度增高，细胞基础胰岛素分泌量明显增多，凋亡明显增加。原代大鼠胰岛β细胞过表达miRNA-126后，胰岛素信号通路中IRS-1/2、Akt及PIK3R2的表达降低，诱导胰岛β细胞凋亡增多。该研究结果证明，高microRNA-126可诱导和加重胰岛素抵抗，为2型糖尿病的发病机制和防治提供新的理论依据及潜在的应用价值。