谷氨酸棒杆菌双组份系统HrrSA、ChrSA分子调控机制及其对血红素合成调控机制研究

Heme plays an important physiological function in the cell. Its intracellular concentration levels are tightly regulated. Exploring the regulation mechanism of heme not only lays the foundation for the metabolic regulation of model strain, but also provide valuable clues to the infection mechanism of pathogenic relative important pathogens. This study, based on the engineered 5-aminolevulinic acid (ALA) producing Corynebacterium glutamicum, is to find and explore the molecular mechanisms of regulation of the two-component regulatory systems HrrSA, ChrSA in heme biosynthesis, by using the new technologies of molecular biology like DNase I footprinting, 5'-RACE method to determine the binding sites and the manner of the regulatory protein acting on DNA. This study also analyzing its biological function and cross-regulation of HrrSA and ChrSA; revealing the impact of the two-component on heme and ALA synthesis by metabolites detected, qPCR and 13C metabolic flux analysis, thus further uncovering heme synthesis regulation mechanism. Then using the two-component regulation model dynamically regulates heme biosynthesis and explores the optimization mechanisms ALA synthesis pathway. This project conducted the in-depth research of the molecular mechanisms of the two-component regulatory system and the regulation mechanism of heme and ALA synthesis, providing a new theoretical foundation for high efficient biosynthetic pathway in metabolic engineering.

血红素（heme）在细胞内发挥着重要的生理功能，其胞内浓度水平受到严格调控。探索heme的调控机制不仅为模式菌株的代谢调控奠定基础，同时也为近源致病菌的侵染机理提供有价值的线索。本研究从产5-氨基乙酰丙酸（ALA）谷氨酸棒杆菌工程菌出发，发现并探索双组份调控系统HrrSA、ChrSA调控heme合成途径的分子机制，利用分子生物学手段DNase I足迹法、5′-RACE法等确定调控蛋白与DNA的结合位点及方式；解析其生物学功能及交叉调控关系；通过代谢产物检测、qPCR、13C代谢流分析手段揭示双组份对heme及ALA合成的影响，进一步揭示heme合成调控机制；最终利用双组份的调控模式动态调控heme生物合成来探索ALA合成途径的优化机制。本项目开展的对双组份调控系统深入分子调控机制研究及对heme、ALA合成的调控机制研究，为代谢工程中高效生物合成途径提供新的理论基础。

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)作为一种环境相容性及选择性高的新型光动力学药物具有非常广阔的应用前景。课题负责人在研究ALA的微生物代谢合成时发现，产ALA工程菌积累形成ALA的同时也造成其下游产物血红素（Heme）过量积累，致使菌体的生长乃至呼吸代谢均受到影响。鉴于heme的重要生理功能，在利用重组菌生产ALA时，heme合成途径不能被阻断或敲除，只能调控弱化。谷氨酸棒杆菌中Heme受到双组分系统HrrSA和ChrSA的调控，项目探索了heme依赖的双组分系统调控heme动态平衡的分子机制，并利用其提高ALA积累、优化其合成机制。项目主要研究了谷氨酸棒杆菌双组份系统HrrSA、ChrSA分子调控机制及其对血红素合成的影响；同时，基于血红素感应的转录调控因子构建了血红素响应的动态调控系统；利用血红素响应的动态调控系统平衡血红素途径相关基因的表达以实现目标化合物的高效生产。对于谷氨酸棒杆菌血红素转运蛋白缺失对血红素代谢调控的影响，我们分别敲除了谷氨酸棒杆菌中的血红素外运蛋白HrtBA和内运蛋白HmuTUV，测定转运蛋白的缺失对于血红素生物合成途径相关基因表达量的影响以及相关中间体积累的影响。同时，我们在ALA生产菌中引入聚羟基丁酸酯PHB以及聚羟基丁酸羟基戊酸酯PHBV的生物合成途径，通过利用乙酰CoA来消除过量的乙酸产生，实现PHA和ALA的联产。接着，利用合成生物学工具，基于感应血红素的转录调控因子HrtR以及基因沉默工具CRISPRi构建了响应血红素的动态调控系统，利用荧光蛋白，实时定量PCR对系统的功能进行表征。同时通过对转录调控因子HrtR的关键位点进行突变以实现对于系统灵敏度的精细调节。将动态调控系统应用于平衡血红素生物合成途径相关基因的表达，产量达到5.35g/L，实现了ALA的进一步高效生产。