胃癌相关血浆circRNA标志物的筛选及RT-ddPCR同时定量检测血浆hsa_circ_0001017和hsa_circ_0061276方法的建立

Circular RNAs (circRNAs) play important roles in the occurrence and development of tumors. The property of structural stable makes circRNAs advantage as a new type of tumor markers. Recently, our group screened some gastric cancer-associated circRNAs and found that hsa_circ_0001017 and hsa_circ_0061276 regulated gastric cancer occurrence. Since that plasma is the most commonly used sample in laboratory medicine; and that reverse transcription-droplet digital polymerase chain reaction (RT-ddPCR) is more suitably used in the detection of plasma RNA-typed markers for its advantages such as high sensitivity, less interference, and absolutely quantitative detection, in this study, we will optimize the size of amplified fragments and primers' concentrations; establish a simultaneously quantitative method of plasma hsa_circ_0001017 and hsa_circ_0061276; analyze the factors that affect the stability of plasma circRNAs; compare the copy changes of plasma hsa_circ_0001017 and hsa_circ_0061276 among health controls, patients with benign gastric cancer, gastric precancerous lesion, early gastric cancer and advantaged gastric cancer; and finally analyze their diagnostic values. The study may improve the non-invasive diagnostic levels of gastric cancer.

环状RNA（circRNA）在肿瘤发生发展过程中起重要作用，而它们的结构高稳定特性使其在作为新型肿瘤标志物方面呈现优势。课题组最近筛选出一些胃癌相关circRNA，并经细胞实验发现hsa_circ_0001017和hsa_circ_0061276调控胃癌发生。由于血浆是最常用的临床检验标本，而逆转录-微滴数字PCR（RT-ddPCR）技术具有灵敏度高、干扰少、绝对定量等优点，特别适用于检测血浆RNA类标志物。为此，本课题将优化扩增片段大小和引物浓度，建立RT-ddPCR同时定量检测血浆hsa_circ_0001017和hsa_circ_0061276的方法；分析影响血浆circRNA稳定性的因素；比较健康人、良性胃病、胃癌前病变、早期胃癌和晚期胃癌等5组人血浆hsa_circ_0001017和hsa_circ_0061276拷贝数的变化规律，分析其诊断价值，希望提高胃癌的非创性诊断水平。

环状RNA(circRNA)是一类具有闭合环状结构的内源性RNA分子。近年来研究表明，circRNA的异常表达可导致肿瘤的发生，而它们是否可作为标志物用于肿瘤的诊断、特别是它们与胃癌的关系在本课题立项之前尚未明确。. 本课题的主要内容包括：(1)采用circRNA芯片筛选出胃癌患者血浆中与癌细胞中同步变化的circRNA；确定胃癌相关circRNA。(2)通过优化扩增片段大小和引物浓度，建立RT-ddPCR技术同时绝对定量地检测血浆hsa_circ_0001017和hsa_circ_0061276的方法。证明常规贮存条件可否满足临床检验要求和外泌体是否对circRNA具有保护作用。(3)通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线，确定血浆hsa_circ_0001017和hsa_circ_0061276在胃癌辅助诊断中的临床价值。. 本课题首次揭示了胃癌相关circRNA的表达谱，筛选得到17种在胃癌组织和血浆中同步变化的circRNA。设计了用于染料法RT-ddPCR的特异性引物，优化了引物浓度的配比，错开扩增片段大小50bp左右，发现hsa_circ_0001017、hsa_circ_0061276和GAPDH能够在同一个反应中被有效区分并同时定量检测，节省了临床检测试剂和时间，为临床检验血浆样本中circRNA的定量检测提供了新方法。证实了胃癌细胞可通过外泌体将circRNA释放至细胞外。证明常规贮存温度和贮存时间对血浆circRNA的稳定性影响不明显。血浆hsa_circ_0001017在区分早期胃癌患者和健康人时，具备较高的早期诊断价值。随着正常胃黏膜发展成慢性萎缩性胃炎-胃溃疡-胃黏膜异型增生-早期-晚期胃癌，血浆中hsa_circ_0001017的绝对拷贝数逐步降低。同时发现，血浆hsa_circ_0061276拷贝数在健康人、早癌组和进展期胃癌组中呈现逐渐降低的趋势。. 本课题揭示了胃癌相关circRNA的表达谱，明确了血浆hsa_circ_0001017和hsa_circ_0061276在胃癌辅助诊断中的价值，对于提高胃癌的诊治水平做出一些贡献。共发表论文8篇，国内学术会议报告4篇，培养研究生3名。