中药血浆药理方法的建立及系统评价研究

The project team has proposed the necessity for the establishment of Chinese medicine plasma pharmacological methods (CPPM) based on the early research results that the differences of the pharmaceutical ingredients between drug-containing plasma(DCP) and drug-containing serum(DCS) after Chinese medicine compounds was gavaged and absorbed into blood using the High performance liquid chromatography mass spectrometry(HPLC-MS) and proteomics , and the the effect of DCP and DCS on the cultureed vascular endothelial cells(VEC). This study will be carried out in two aspects of methodology research and systematic evaluation for eatablishment of CPPM. The method of component analysis and efficacy validation will be used in resaerch of methodology of CPPM. Preparation and preservation of DCP will be researched in choice of plasma donor, drug concentration administrated, time of administration, anticoagulant choice, plasma separation. Building the bioreactor system in vitro will be developed in penetration pressure, ionic strength. Systematic evalution of CPPM will be vestigated in its reliability and repeatability. The accuracy of CPPM is evaluted to the degree of deviation of effects of BYHWT-containing plasma and BYHWT-containing serum on the hypoxic rat brain microvascular endothelial cells (BMECs) compared with the real results of classical pharmacological experiments. The repeatability of CPPM is evaluted to coefficient of variation that calculated by the indicators of five batches of hypoxic rat BMECs. The establishment of CPPM has important value of application in the research fields of Chinese medicine pharmacology and basic integrative medicine as a new complementary method.

项目组前期采用LC-MS和蛋白组学比较中药复方入血后含药血浆（DCP）和含药血清（DCS）药物成分及对培养的血管内皮细胞（VEC）作用的差异，提出了建立中药血浆药理方法（CPPM）的必要性。本研究拟从方法学和系统评价两方面探讨CPPM的建立。方法学研究采用入血成份比较和药效验证的方法，从血浆来源生物体选择、给药浓度、给药时间、抗凝剂选择、血浆分离等方面探讨DCP的制备与保存，从渗透压、离子强度等方面探索体外反应体系的构建。系统评价研究重点考察CPPM的可靠性和重复性；以经典药理实验结果为真实值，观察补阳还五汤（BYHWT）DCP和DCS对缺氧大鼠脑BMECs作用的偏离程度以评价CPPM的准确度，观测5批次缺氧大鼠BMECs各指标的变异系数以评价CPPM的重复性。该方法的建立将为中药药效学和中药作用机理研究补充新的方法，在中药药理学研究和中西医结合基础研究领域有着重要的应用价值。

中药血浆药理方法是相对于中药血清药理学方法而提出的一种新的研究中药药效（药理）的半体内实验研究方法。该方法能避免血液凝固过程中及其继发的一系列生物学反应对血液原有成分及药物入血成分的影响，中药血浆药理方法应用于体外反应体系更加接近药物进入体内的环境，所获得结果相对真实可靠。完善和发展中药血浆药理方法是可行的和必要的。. 本研究从方法学和系统评价两方面探讨中药血浆药理学方法的建立。方法学研究主要从给药剂量、给药时间、采血时间、抗凝剂选择、供体选择、保存条件等方面比较中药含药血浆（DCP）与含药血清（DCS）有效成分差异。系统评价观察补阳还五汤（BHD）的DCP和DCS 对缺氧大鼠脑大鼠脑血管内皮细胞（BMECs）作用的偏离程度以评价CPPM 的准确度和重复性。. 方法学研究结果表明，黄芩和BHD大鼠DCP和DCS有效成分含量随给药剂量、时间、采血时间不同而存在差异，连续灌胃给药3天并末次给药后1h取血，其有效成分含量相对较高；不同抗凝剂制备的苦参、调胃承气汤DCP和DCS中有效成分存在差异，但离子强度基本一致；从大鼠、兔、猴动物中制备的含人参和四君子汤的DCP和DCS有效成分含量无显著差异；桂枝含药DCP和DCS中桂皮酸浓度与保存时间和保存温度有关，含药血浆的保存条件推荐-20℃冰冻保存不超过60天或-80℃超低温保存不超过180天； 麻黄汤含药血浆蛋白组学结果比含药血清更接近血液真实值；延胡索、水蛭、朱砂、四物汤DCP和DCS对体外反应体系DMEM培养液的渗透压和PH值影响显著差异。. 系统评价研究结果表明，DCP组vWF与体内实验相关系数高于DCS组，差异性有显著性（P＜0.05)；DCP组NO、6-keto-PGF1α与体内实验相关系数接近于DCS组与体内实验相关系数，差异无显著性（P＞0.05)；DCP组PAI-1、tPA、ICAM-1、VCAM-1、ICAM-1mRNA及VCAM-1mRNA与体内实验真实值各指标相关系数均高于DCS，差异有显著性（P＜0.05)。. 该课题探讨建立和完善中药血浆药理学技术方法， 进一步解决制约中药药效学和药物作用机理体外研究的瓶颈问题，在中药药理药效学研究和中西医结合基础研究领域有着重要的应用价值。