rhEPO对肝外阻塞性黄疸肠粘膜屏障功能的影响及机制的研究

肝外阻塞性黄疸是临床上常见的疾病，病人常死于败血症。肠黏膜屏障损伤引起所谓"肠源性脓毒症"被认为是其机制之一。手术或介入解除梗阻是治疗胆道梗阻的主要手段，但部分病人不能耐受或不适合，因此药物治疗必不可少。EPO对于多种组织、器官有着多途径的保护作用，但是阻塞性黄疸时肠粘膜组织 EPO 受体表达分布特征及调控机制至今未有研究。在前期研究中，我们发现外源性rhEPO能够改善大鼠肝外阻塞性黄疸引起肠黏膜屏障功能障碍，我们推测与肠粘膜组织存在 EPO/EPO 受体的内源性保护机制有关，并可能通过对肠粘膜上皮细胞HSP70、HMGB-1表达的影响以及对p38MAPK/iNOS炎症通路的调控发挥作用。为证实这一假说，我们将分别通过体内和体外实验观察外源性EPO治疗对EPO受体、肠粘膜屏障的影响及其信号通路，探讨其最佳治疗时间窗，为临床使用 rhEPO 治疗阻塞性黄疸时肠粘膜屏障功能障碍提供理论依据。

EPO对于多种组织、器官有着多途径的保护作用，本研究通过体外和体内实验研究EPO对阻塞性黄疸引起的肠黏膜屏障损伤的作用及机制。结果发现，（1）利用基因和蛋白质融合技术，构建pEGFP 转染的E. coli TG1示踪菌并使其在大鼠肠道定位。被转化的细菌具有氨苄西林抗性，在含有氨苄西林的培养液上，可方便地对目的细菌进行分离和鉴定，从而证实多器官细菌移位的肠道来源。GFP示踪技术是一种简单、可靠和有效的观察细菌移位的方法。（2）利用胆总管结扎（BDL）制作大鼠阻塞性黄疸的动物模型。阻塞性黄疸导致明显的肠粘膜组织病理损害及紧密连接蛋白表达下降，进一步引起肠粘膜屏障功能障碍及细菌移位。我们在大鼠体内首次应用EZ-link Sulfo-NHS-Biotin为分子指示剂，通过免疫荧光技术检测肠粘膜对指示剂的渗透性，简单直观的反映肠粘膜通透性。（3）体外实验研究表明rhEPO对去血清及胆红素处理的Caco-2细胞屏障功能具有保护作用，与促进细胞增殖及减少细胞凋亡有关。进一步研究表明rhEPO通过诱导HO-1表达而发挥细胞保护作用，应用MAPK抑制剂干预研究提示rhEPO诱导HO-1表达受p38MAPK通路的调控。rhEPO能促进EPOR mRNA 及EPOR蛋白的表达，rhEPO作用发挥可能依赖EPO-EPOR信号转导机制。（4）体内试验研究表明rhEPO能明显改善梗阻性黄疸导致的贫血，晚期（胆管结扎术后4-6周）小剂量应用rhEPO能改善肠黏膜屏障功能障碍，与减轻氧化应激损伤、促进肠黏膜细胞周转(turnover)及下调HMGB-1、iNOS表达有关。但早期（胆管结扎术后0-2周）应用rhEPO或晚期大剂量应用rhEPO均无益于梗阻性黄疸，可能与其诱导HO-1表达进一步增加胆红素生成、促进炎症反应及加剧肠黏膜细胞凋亡有关。我们研究提示，对于急性梗阻性黄疸病人应避免使用EPO，而胆汁淤积性肝硬化病人使用EPO能纠正贫血，对肠粘膜屏障功能可能有保护作用，但仍应小剂量谨慎使用，并需监测胆红素水平。此研究结论对临床应用EPO有很重要的指导意义，在国内外研究中未有报道，rhEPO说明书中亦未有说明。