针刺干预内质网应激调节脑缺血再灌注大鼠神经细胞自噬的分子机制研究

Cerebral ischemia reperfusion injury directly affects the prognosis of cerebrovascular disease,so how to actively reduce cerebral ischemia and reperfusion injury is the key piont in preventing and treating cerebral ischemia disease.New research shows that autophagy as new programmed cell death way,plays an important role in the switch of "live" and "destroy" in cells. Meanwhile Unfolded protein response(UPR) responsed in endoplasmic reticulum stress(ERS) is an important signalling pathway to induce cells autophagy.Based on this new scientific discovery, and the clinical and experimental evidence in our earlier researches on treating cerebral ischemia by acupuncture, the project is using middle cerebral artery occlusion/reperfusion(MCAO/R) rat models and techniques of real-time fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR), western blot and RNAi. The effect of UPR signalling pathways regulating autophagy by needling Shuigou(DU 26) after cerebral ischemia and reperfusion injury would be dynamically observed.From the molecule function way of three signal transduction pathways PERK/elF2α, Ire1/TRAF2, ATF6α of UPR, the mechanism of autophagy,material base and effective acting targets by needling Shuigou(DU 26) after cerebral ischemia reperfusion injury would be further explained. It can provide experimental and theoretical basis of treating cerebral ischemia by acupuncture for the clinical application.

脑缺血再灌注损伤直接影响脑血管病的预后转归，如何积极减轻脑缺血再灌注损伤是防治脑缺血性疾病的关键。新近研究表明，自噬作为新的程序性细胞死亡方式，在细胞"存活"与"毁灭"切换中的意义重大。而内质网应激中非折叠蛋白质反应(UPR)是诱导细胞自噬的重要信号通路。基于这一新的科学发现，以及课题组前期有关针刺治疗脑缺血的临床与实验室研究证据，本项目拟采用大脑中动脉栓塞局灶性缺血再灌注大鼠模型，运用实时荧光定量PCR、western blot、RNA干扰等技术，通过动态观察针刺水沟穴对脑缺血再灌注损伤后内质网应激UPR信号转导通路诱导自噬的影响，从内质网应激UPR三条信号转导通路PERK/elF2α、Ire1/TRAF2、ATF6α的分子作用途径深入阐释脑缺血再灌注损伤后自噬的作用机制以及针刺水沟穴减轻脑缺血再灌注损伤可能物质基础与有效作用靶点，为针刺治疗脑缺血的临床应用提供实验与理论依据。

脑缺血再灌注损伤直接影响脑血管病的预后转归，如何积极减轻脑缺血再灌注损伤是防治脑缺血性疾病的关键。自噬作为新的程序性细胞死亡方式，在细胞“存活”与“毁灭”切换中的意义重大。而内质网应激中非折叠蛋白质反应(UPR)是诱导细胞自噬的重要信号通路。基于这一新的科学发现，以及课题组前期有关针刺治疗脑缺血的临床与实验室研究证据，本项目采用大脑中动脉栓塞局灶性缺血再灌注大鼠模型，运用实时荧光定量PCR、western blot、RNA 干扰等技术，通过动态观察针刺水沟穴对脑缺血再灌注损伤后内质网应激UPR 信号转导通路诱导自噬的影响，从内质网应激UPR 三条信号转导通路PERK/elF2α，Ire1/TRAF2，ATF6α的分子作用途径深入阐释脑缺血再灌注损伤后自噬的作用机制以及针刺水沟穴减轻脑缺血再灌注损伤可能物质基础与有效作用靶点。.结果表明：1.针刺水沟治疗大鼠脑缺血再灌注损伤，神经功能缺损评分和TTC染色示脑梗死体积均较于模型组明显减小，且在24h时差异最为显著，治疗效果确切。2. 大鼠脑缺血再灌注后6h、24h时点电镜观察自噬泡形成，线粒体肿胀变性，内质网扩张等形态学变化。再灌注后72h时点出现严重形态学改变。表明大鼠在缺血再灌注损失后自噬被激活。针刺水沟穴发现能够拮抗MCAO∕R大鼠自噬相关蛋白Beclin-l和LC3B-II的上调和p62的表达下调，且 24h时达到峰值。表明电针水沟穴减轻脑缺血再灌注大鼠神经功能损伤和抑制过度自噬相关。3.模型大鼠MCAO∕R内质网应激启动，ERS标志蛋白GRP78、CHOP的表达上调，而各时点针刺组的GRP78较同时点的模型组表达上调而CHOP较同时点的模型组表达下调，推测针刺水沟可能通过上调GRP78，抑制CHOP来起到阻断ERS诱导的过度自噬来实现大鼠脑缺血再灌注损伤的减轻。但其机制尚需进一步验证。4. UPR三条信号转导通路PERK/elF2α，Ire1/TRAF2，ATF6αWestern Blot结果显示大鼠MCAO∕R 24h后PERK 、p-eIF2α和IRE1蛋白的表达明显上调，而针刺组PERK 、p-eIF2α和IRE1蛋白的表达较模型组表达降低。而ATF6α未被检测到。说明针刺下调PERK、p-eIF2α、IRE1α，通过对内质网应激UPR相关信号通路的干预，减轻过度自噬，对MCAO∕R大鼠起到脑保护作用。