基于PERK/elF2α通路研究针刺调控MCAO/R大鼠内质网应激-自噬稳态重构的分子机制

Our previous studies found that: acupuncture has definite effect on preventing and treating cerebral ischemia reperfusion injury (CIRI)，through regulating the expression of related apoptotic factors，to protect the damaged nerve cells and promote neurological recovery. This study further explores the imbalance of homeostasis on endoplasmic reticulum stress (ERS)-autophagy，try to find the possible mechanisms of its CIRI's antagonism. Copy the MCAO/R rats model，apply electron microscopy，Real-time PCR，Western blot and immunofluorescence staining methods，focus on how to influence the expression of autophagy，GRP78，autophagy-related molecules and the key access factors p-PERK，p-elF2α，ATF4，CHOP，Bcl2 by acupuncture treatment after cerebral ischemia reperfusion（CIR）. Further elaborate mechanism of autophagy of nerve cells after CIR and the possible material basis and potential valid targets of acupuncture treat CIRI. And then to verify the scientific hypothesis that "acupuncture stimulating - feedback regulation of UPR - moderate activation of autophagy - ERS and autophagy homeostasis reconstruction- neuronal repair star. " These are the key mechanisms for neuronal repair and remodeling by acupuncture treatment after CIRI.This study provides new scientific evidences and broadens the horizon for acupuncture in the treatment of cerebral infarction.

基于课题组前期研究发现：针刺防治脑缺血再灌注损伤（CIRI）疗效肯定，可通过调控凋亡相关因子表达，保护受损神经细胞、促进神经功能修复。本研究进一步从内质网应激（ERS）-自噬稳态平衡角度，探讨针刺拮抗CIRI的可能机制。复制MCAO/R大鼠模型，应用电镜、免疫荧光组化、Western blot和Real-time PCR等技术，重点研究针刺对脑缺血再灌注（CIR）后自噬体、GRP78、自噬相关分子以及通路关键因子p-PERK、p-elF2α、ATF4、CHOP、Bcl2表达的影响；首次从PERK/elF2α信号通路的分子作用途径深入阐释CIR后神经细胞自噬的作用机制以及针刺减轻CIR后神经损伤的可能物质基础与有效作用靶点，进而验证“针刺刺激-正反馈或负反馈调控UPR-诱导神经细胞自噬适度激活-ERS与自噬稳态重构-神经细胞自体修复启动”的科学假说，为针刺治疗脑梗死提供全新科学依据。

自噬作为新的程序性细胞死亡方式对细胞"存活"与"毁灭"意义重大，而内质网应激（ERS）-未折叠蛋白质反应(UPR)是诱导及调控细胞自噬的重要分子机制。因此，本项目通过制备MCAO/R大鼠模型，运用rt-PCR、Western Blot、电镜和免疫组化等技术，通过动态观察针刺对脑缺血再灌注（CIRI）后ERS诱导自噬的影响；从UPR的PERK/elF2α信号通路的分子作用途径深入阐释CIRI后神经细胞自噬的作用机制以及针刺减轻CIRI的可能物质基础与有效作用靶点。结果表明：（1）大鼠IR24h，ERS诱导神经细胞自噬适度激活，对神经细胞损伤起保护作用；IR72h，ERS诱导神经细胞自噬过度激活，加重神经细胞的损伤。（2）PERK/elF2α信号通路正反馈因子PERK、EIF2、ATF4在CIRI后高表达，且与脑组织中GRP78、Beclin1、LC3B高表达的动态变化一致，提示PERK/EIF2α通路对大鼠CIRI后ERS诱导神经细胞自噬具有调控作用。（3）针刺对大鼠CIRI后神经细胞自噬具有双向良性调节作用：针刺在大鼠IR24h、IR7d神经细胞自噬处于适度激活时，通过上调PERK/elF2α通路正反馈因子表达，进一步促进自噬的适度激活，保护受损的神经细胞；而在IR72h神经细胞过度自噬时，又通过下调GRP78、PERK、EIF2、ATF4蛋白和mRNA表达，抑制自噬，恢复神经细胞内环境的稳态，发挥神经保护作用。（4）针刺通过调控PERK/EIF2通路的关键蛋白，正反馈或负反馈调控UPR，使其诱导神经细胞自噬的适度激活，促进内质网应激-自噬的稳态重构，进而保护神经细胞、促进神经细胞的自体修复---从而验证了“针刺刺激-正反馈或负反馈调控UPR-诱导神经细胞自噬的适度激活-内质网应激与自噬的稳态重构-神经细胞的自体修复启动”是针刺促进CIRI后神经修复与重塑的可能作用机制之一的科学假说。为针刺治疗CIRI提供了全新的科学依据，为CIRI的治疗研究拓宽了思路。