ERK信号通路在翼状胬肉上皮异常分化中的作用

翼状胬肉是常见影响视力的眼表增生性疾病。发病机制仍不明了常规治疗方法存在较高的复发率。胬肉上皮细胞在发病机制中起重要作用，ERK信号通路激活呈高水平表达。本研究探讨ERK信号通路在翼状胬肉上皮异常分化中的作用。采用3T3饲细胞体外克隆化培养及组织块培养法扩增翼状胬肉及正常结膜上皮细胞。并运用ERK信号通路抑制剂，观察阻断后克隆形成率、组织块扩增面积、MTT检测及K10表达探讨对上皮细胞增殖状态及异常分化的影响。扩增胬肉上皮细胞紫外线暴露后，运用免疫组化，Western blot及流式细胞学方法确定阻断后组织块内和体外扩增的翼状胬肉上皮异常分化K10及胬肉正常表型K12,K19的表达比例水平改变，并运用信号通路基因芯片检测通路阻断前后通路下游基因PPAR、ELK-1、c-Myc水平的改变。以期探讨ERK信号通路在翼状胬肉上皮异常分化中的作用，为其抑制剂运用临床辅助治疗降低复发率提供一定依据。

本研究主要观察翼状胬肉不同部位上皮细胞异常分化的水平差异，探讨细胞外信号通路ERK在体外培养的翼状胬肉不同部位上皮细胞异常分化中的调控作用。进一步研究ERK信号通路是否影响翼状胬肉成纤维细胞迁徙能力和VEGF及其受体VEGFR2蛋白表达水平及其具体机制。1.运用免疫组织化学观察组织中翼状胬肉头部和体部K19、K10、Pax-6、ERK、p-ERK、β-catenin和CyclinD1蛋白表达水平差异。2.在培养的翼状胬肉上皮细胞克隆中观察头部和体部上皮细胞克隆的不同表型蛋白表达差异。加入ERK信号通路抑制剂PD98059培养后，观察表达差异的改变。3.观察体外原代培养翼状胬肉和正常结膜成纤维上皮细胞迁徙能力差异。为探讨其机制将翼状胬肉上皮细胞和羊膜间充质干细胞共培养后，检测成纤维细胞迁徙能力和α-SMA蛋白的表达水平变化。4.并进一步研究ERK信号通路对翼状胬肉成纤维细胞中VEGF及其受体VEGFR的表达水平改变。研究结果提示1.翼状胬肉头部正常表型蛋白K19，Pax-6表达水平显著低于翼状胬肉体部，而异常分化表型K10和CyclinD1蛋白表达水平明显提高，多个细胞信号通路被异常激活。ERK、p-ERK、β-catenin表达在翼状胬肉头部上皮细胞明显增加。2.在体外克隆化培养的翼状胬肉上皮细胞中，观察到相似结果。而ERK信号通路在翼状胬肉头部上皮克隆细胞中异常激活。运用抑制剂PD98059阻断ERK1/2信号通路后，能明显提高正常表型K19，Pax-6表达水平，并降低异常分化表型K10蛋白表达。3.翼状胬肉成纤维细胞迁徙能力明显高于正常结膜成纤维细胞。加入抑制剂PD98059后能明显降低其迁徙能力。与羊膜间充质干细胞共培养后迁徙能力下降，α-SMA蛋白的表达水平降低。4.翼状胬肉成纤维细胞VEGF及其受体VEGFR表达明显增加。紫外线照射也能加强这种效应。培养液中加入ERK信号通路抑制剂能降低其VEGF及其受体VEGFR蛋白表达水平。研究结果提示翼状胬肉上皮细胞的异常分化主要存在于头部，而体部较少出现。ERK信号通路在头部异常激活，加入抑制剂能下调上皮细胞的异常分化。翼状胬肉成纤维细胞的迁徙能力明显增强，ERK信号通路可能参与其迁徙能力的调控，并参与成纤维细胞中VEGF和VEGFR蛋白表达调控。进一步研究将深入ERK信号通路在翼状胬肉上皮和成纤维细胞中调控机制。