噬菌体源聚糖酶的异源表达及其对海洋岩藻糖基聚糖的多靶点催化机制研究

Fucose-based polysaccharide is a kind of sulfated heteropolysaccharide with diversified structure, with fucose as the main component, binding different monosaccharides and substituent groups, such as sulfur and uronic acid. It is one of the most important components in seaweed and sea cucumber, providing them important physiological functions. Fucose is also the common unit comprising the bacterial extracellular polysaccharides. Bacteriophage-borne glycanase may degrade the bacterial extracellular polysaccharides and release fucose-containing oligosaccharides. It means that bacteriophage-borne glycanase can be used as a tool for the structure analysis of marine fucose-based polysaccharides and for the preparation of marine specific oligosaccharides. This project aims to screen out the bacteriophages using the bacteria producing fucose-based extracellular polysaccharide as the host cell, and to evaluate their ability of producing glycanase. After whole-genome sequencing and encoding gene analysis of bacteriophages, the heterologous expression of gene encoding bacteriophage-borne glycanase will be carried out in E. coli. According to the highly complex structure of marine fucose-based polysaccharides, we will establish an enzyme system based on bacteriophage-borne glycanase to act on the different targeting points of the polysaccharides. The enzyme system will be used to for the analysis of the complex structure of marine fucose-based polysaccharides. Besides, the multiple targeting catalytic mechanism will also be intensively studied.

岩藻糖基聚糖是一类由岩藻糖为主要单元，结合多种单糖残基以及硫酸基、糖醛酸等取代基复合而成最具多元化结构特点的硫酸化杂聚多糖，是海藻、海参等海洋生物主要的组成成分之一，也赋予了这些海洋生物产品重要的生理功效。岩藻糖也是细菌胞外多糖的常见组成单元，利用噬菌体源聚糖酶可以降解细菌胞外多糖并释放出岩藻寡糖，从而可借鉴为海洋岩藻糖基聚糖结构解析和特定寡糖制备的有效工具。本项目以产生岩藻糖基胞外多糖的细菌作为宿主细菌，定向筛选系列噬菌体并对其胞外多糖降解酶的产生性能进行评价；通过噬菌体全基因组测序与功能基因解析，推测出可能的聚糖酶编码基因，在大肠杆菌中完成噬菌体聚糖酶基因的异源表达；针对海洋岩藻糖基聚糖组成结构高度复杂的特点，构建作用于聚糖不同靶点的噬菌体聚糖酶系，解决海洋岩藻糖基聚糖复杂结构难以解析的问题，并阐明所构建酶系对海洋岩藻糖基聚糖的协同降解和定向催化机制。

岩藻糖基聚糖是一类由岩藻糖为主要单元，结合多种单糖残基以及硫酸基、糖醛酸等取代基复合而成最具多元化结构特点的硫酸化杂聚多糖，是海藻、海参等海洋生物主要的组成成分之一，也赋予了这些海洋生物产品重要的生理功效。岩藻糖也是细菌胞外多糖的常见组成单元，利用噬菌体源聚糖酶可以降解细菌胞外多糖并释放出岩藻寡糖，从而可借鉴为海洋岩藻糖基聚糖结构解析和特定寡糖制备的有效工具。本项目以产生岩藻糖基胞外多糖的细菌作为宿主细菌，建立了细菌胞外多糖的液体发酵技术，为新型结构的岩藻糖基化多糖的发掘提供了新材料和新方法；定向筛选系列噬菌体并对其胞外多糖降解酶的产生性能进行评价，为新型岩藻糖基化寡糖的制备提供了新型的酶解技术；通过噬菌体全基因组测序与功能基因解析，推测出可能的聚糖酶编码基因，使用PSI-BLAST工具预测Gp190很有可能就是编码噬菌体多糖解聚酶的基因，并进行了大肠杆菌异源表达的探索性研究；利用噬菌体多糖解聚酶酶解宿主胞外多糖FcEPS，制备出新型结构的岩藻寡糖，并完成了寡糖的结构解析；针对海洋岩藻糖基聚糖组成结构高度复杂的特点，构建作用于聚糖不同靶点的噬菌体聚糖酶系，证明褐藻源岩藻糖基聚糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，建立了褐藻源岩藻糖基聚糖的降解条件；系统评价了岩藻糖基化寡糖的益生元活性，岩藻糖基化二糖和三糖均证明具有良好的益生元活性，可被肠道中典型益生菌利用并代谢产生有益代谢产物，且与母乳寡糖2'-FL 相比在对益生菌的选择性增殖和促进SCFAs产生方面具有一定的优势。该研究为新型益生元的开发，特别是母乳寡糖的替代产品的开发，提供了新的技术思路；同时也为新型岩藻寡糖的构效关系研究，提供了具有多样性结构的寡糖资源。