海洋噬菌体及其聚糖降解酶的研究与应用

海洋细菌胞外多糖是一种结构新颖、功能独特的海洋天然产物，通常是由具有特定序列的重复单位构成；而噬菌体在侵染宿主细胞过程中释放出的聚糖降解酶，能够特异性作用于宿主胞外多糖，通过酶解作用使其中的重复序列得以释放，从而产生结构新型的寡糖。本项目计划以海洋噬菌体及其聚糖降解酶为研究对象，从海洋噬菌体中提取并纯化出高效聚糖降解酶，确定噬菌体聚糖降解酶的酶学性质和化学结构；以海洋细菌胞外多糖为底物进行酶解反应，分析酶解产物的组成和结构，以确定聚糖降解酶的作用特点；并完成噬菌体聚糖降解酶在原核生物细胞中的克隆表达。本项目拟在为未来多种类型的海洋噬菌体聚糖降解酶的批量制备、致病菌生物膜的研究与破坏以及新型功能寡糖的开发，探索出一种行之有效的新途径和新方法。

海洋细菌胞外多糖是一种结构新颖、功能独特的海洋天然产物，通常是由具有特定序列的重复单位构成；而噬菌体在侵染宿主细胞过程中释放出的聚糖降解酶，能够特异性作用于宿主胞外多糖，通过酶解作用使其中的重复序列得以释放，从而产生结构新型的寡糖。本项目从海洋环境中筛选出20余株噬菌体，以Klebsiella K13的噬菌体聚糖酶为工具，对Klebsiella K13胞外多糖进行降解，得到产物稳定的小分子量寡糖。酶解产物经Bio-Gel P4凝胶柱及Bio-Gel P6凝胶柱分离纯化，得到三个低分子量的组分。通过气相色谱分析对胞外多糖的单糖组分进行分析，发现此胞外多糖由葡萄糖、甘露糖和半乳糖三种单糖组成。借助于ESI-CID-MS分析，确定了各寡糖组分的分子量，并确定各片段分别为五糖、十糖、十五糖。经红外光谱分析，发现寡糖含有糖醛酸等特征官能团。通过一维核磁共振波谱分析和二维核磁共振波谱分析，确定了寡糖组分的基本结构。.噬菌体P13潜伏期约为20 min，爆发期约为40 min，属于烈性噬菌体。形态学分析发现其头部直径约为50 nm，并具有较短的尾部。采用高通量测序法对其基因组序列进行测定并研究其结构特征，发现基因组长度为45 976 bp，为线性双链DNA。对噬菌体P13基因组的生物信息学进行分析，发现在P13基因组中共具有282个长度大于100bp的ORFs，其中有50个ORFs为假定基因，基因总长度为41 329 bp，基因平均长度为833 bp。在50个假定基因中，有40个基因可找到同源性序列，其中26个基因已确定了功能，推断出基因49及基因50为可能的多糖解聚酶基因。基于分子生物学实验方法，已成功构建了含有目的基因重组质粒的工程菌。.噬菌体聚糖酶对生物被膜具有显著降解作用，平板擦拭计数法显示酶处理4h对生物被膜细菌数量的影响最为显著，80%的细菌被清除。噬菌体聚糖酶预处理还可有效提高消毒剂二氧化氯对生物被膜细菌的清除率。实验通过扫描电镜（SEM）观察酶处理不同时间的生物被膜细菌及胞外多糖的结构变化、单位面积生物被膜细菌群落数量的变化，观察结果表明，噬菌体聚糖酶能够有效减少处于连结状态的细菌和生物被膜中的胞外物质，噬菌体聚糖酶对生物被膜具有高效的降解性能，有可能开发成为一种去除生物被膜的重要工具。