耐热型β-木聚糖酶基因的异源高效表达及突变研究

One of the principal scientific items in the anti-aging preservation for the Chinese steamed bread is to obtain the safe thermostable xylanase with high-level production, overcome the low transformation efficiency, the low rate of synthesizing the heterologous protein and the hydrolytic action of endogenous protease in Filamentous Fungi. In current projects, through the method of DNA insertion mediation system, expression vector suitable for Aspergillus oryzae will be constructed and screened to enhance the transformation efficiency, meanwhile the biosynthesis system of Aspergillus oryzae for the high-level expression of thermostable β-xylanase gene mutant will be established according to the method of homologous recombination so as to obtain the expression system of Filamentous Fungi suitable for the food industry with high safety. This project will hopefully elucidate the law of synthesis and secretion of heterologous β-xylanase in Aspergillus oryzae, provide the theoretical basis for using the Aspergillus oryzae as the synthesis biological platform of heterologous protein, and obtain the high-level expression of thermostable xylanase with high activity and safety suitable for the production of Chinese steamed bread by genetic engineering method. The successful implementation of the project will not only enrich the technology and basic theory of expression of heterologous protein in the expression system of Filamentous Fungi, but also provide the effective method, basic data and parameters for solving the aging and quality problem of Chinese steamed bread, and promote the industrialization process of Chinese steamed bread.

突破丝状真菌低转化率、低外源蛋白合成效率及内源性蛋白酶的水解作用，获得来源安全、产量高的耐热木聚糖酶是破解我国传统主食馒头抗老化保鲜技术难题的关键科学问题之一。本课题拟采用DNA介导转化系统的方法，构建并筛选获得适合转化米曲霉的强表达整合型载体来提高转化效率，利用同源重组方法获得蛋白酶基因缺失菌株，构建米曲霉高效表达耐热β-木聚糖酶基因突变体的生物合成体系，以期获得高效表达的适合食品工业生产的高安全性丝状真菌表达系统；为揭示米曲霉菌体异源β-木聚糖酶合成控制规律，利用米曲霉作为异源蛋白质合成生物平台提供理论依据；实现高活性耐热木聚糖酶的安全高效表达，获得适用于中国传统主食馒头加工过程的产量高、安全性好的特异性酶。本项目不仅能够为丝状真菌高效表达异源蛋白的相关理论提供参考，也能为解决馒头老化问题、提高其品质提供有效方法和基础数据，为推进馒头生产的工业化进程奠定科学基础。

项目研究团队完成教酒链霉菌L1105木聚糖酶基因xynA的生物信息学分析，基因表达，酶结构分析，性质研究等工作。利用易错PCR体外分子定向进化技术对枝链霉菌L2001木聚糖酶及教酒链霉菌L1105木聚糖酶进行分子改良，获得特异性增强的稳定突变体，并探究了中国传统发酵面制品中的应用特点，以利于该酶的进一步工业化生产应用。.项目着重研究了教酒链霉菌L1105木聚糖酶分子碳端结构域，探索含CTD的多区域木聚糖酶结构中非催化结构对催化功能的影响机制，厘清了木聚糖酶多区域结构中非催化的CTD结构的作用，为构建高效表达耐热β-木聚糖酶基因突变体的生物合成体系奠定基础。采用高效定向技术及宏基因组学技术对木聚糖酶资源进行进一步的发掘，获得了一株来源新颖的放线菌菌株L10608及非培养的木聚糖酶新基因xynA1-19，为构建高效表达的适合食品工业生产的高安全性丝状真菌表达系统提供新木聚糖酶基因资源。.项目团队从生产应用对木聚糖酶需要出发，结合实验室已筛选的产木聚糖酶的基因资源，运用基因工程及蛋白质工程技术等手段，系统开展了耐热、耐酸及非培养的β-木聚糖酶基因的克隆、表达、突变及蛋白质分子改造、异源蛋白高效表达的基本变化规律等研究工作。从酶水解特异性及酸性木聚糖酶耐热性的角度，针对多样化的研究材料编码木聚糖酶基因序列，对嗜热踝节菌F1208、娄彻氏链霉菌L10904及微紫青霉MA21601重组木聚糖酶等进行分子改造，探讨：1）木聚糖酶N端及C端改造对其水解特性改善的分子机制；2）微紫青霉酸性木聚糖酶XynA基因的克隆与序列分析；3）木聚糖酶催化特异性产物生成机制。.本项目成果对于丰富我国木聚糖酶资源，实现高活性耐热木聚糖酶的安全高效表达，获得更多极具特色的适用于中国传统主食馒头加工过程的产量高、安全性好的特异性优良木聚糖酶提供了技术支撑，也为解决中国传统发酵面制品等老化问题、提高其品质提供基础数据。.至项目结题，已撰写并发表究论文33篇，其中SCI收录11篇；EI收录3篇，核心期刊论文17篇；申请国家发明专利6项，其中获授权专利2项；获省部级以上科技奖励6项；硕士毕业论文9篇。