基于胰腺癌内皮细胞的miRNAs差异表达及治疗性AngiomiRs的的筛选

既往肿瘤抗血管生成研究中miRNAs差异表达的研究是建立在正常内皮细胞的基础之上的。与之不同并深入一步的是，本项目在前期成功建立的胰腺癌内皮细胞分离纯化平台的基础上，以正常血管内皮细胞为对照，采用高通量miRNAs表达谱芯片分析系统研究两种胰腺癌内皮细胞的miRNAs异常表达。在应用pMIR-REPORT系统上调、下调差异表达的待选miRNAs的条件下，研究胰腺癌内皮细胞的增殖、迁移及血管生成能力，体外筛选出对胰腺癌内皮细胞具有明显作用的miRNAs（即AngiomiRs），并进一步通过裸鼠胰腺癌原位接种模型以及活体成像技术观察裸鼠成瘤及转移情况研究上调、下调AngiomiRs对胰腺癌生长及血管生成的作用，验证并筛选出新的治疗性AngiomiRs，为胰腺癌抗血管生成治疗的寻找新的靶点。本项目希望在胰腺癌抗血管生成的研究中进行一些基础的、原创性的探索，为胰腺癌的治疗提供实验依据和理论基础。

本项目已经基本完成，虽有少部分实验尚处于收尾阶段，但是已经明确地取得了三方面的研究成果。.第一是建立了胰腺癌内皮细胞分离纯化、鉴定的方法。以正常血管内皮细胞替代肿瘤内皮细胞进行抗肿瘤血管生成研究是一种间接、模拟的研究方式，其局限性显而易见，而以肿瘤内皮细胞为研究对象可提供更为直接、有效、真实的证据。我们应用免疫磁珠技术，以结合有CD31单克隆抗体的磁珠从胰腺原位移植瘤和人胰腺癌组织中分离纯化胰腺癌内皮细胞，通过光学显微镜观察、免疫荧光染色和乙酰化低密度脂蛋白摄取实验从细胞形态、表面标记物和功能三个层面进行鉴定。结果发现CD31阳性细胞在光学显微镜下呈典型“铺路石样”改变，CD34/VE-cadherin、CD31/VEGFR-2免疫荧光双染色均为阳性，95%以上的细胞DiI标记的Ac-LDL摄取实验结果呈阳性。本研究成功建立了胰腺癌内皮细胞的分离纯化、鉴定方法，可用于胰腺癌肿瘤血管发生机制和抗肿瘤血管生成新药的研究。.第二是研究了胰腺癌内皮细胞的生物学特性。本课题组进一步研究了胰腺癌内皮细胞的形态学特征、种属来源、遗传学特征、体外血管形成能力、增殖能力等生物学特征。发现在适合的培养条件下，胰腺癌内皮细胞每2-3天传代一次，融合状态时呈单层生长，呈现“铺路石样”特征。胰腺癌内皮细胞的种属类型为人，且可见大量的多倍体和非整数倍染色体的细胞出现，以及核内染色体缺失，错位以及许多无法分析的片段。胰腺癌血管内皮细胞在体外能够形成中空的管状结构。胰腺癌内皮细胞的种属来源与胰腺癌肿瘤细胞相同，具有血管内皮细胞的典型形态特征和体外血管生成能力，具有遗传不稳定性和活跃的增殖能力。.第三是明确筛选出差异化表达的miR-182和miR-200c作为AngiomiRs。我们以胰腺癌内皮细胞与癌旁组织的正常血管内皮细胞为研究对象，应用miRNAs表达谱芯片分析系统进行miRNAs的差异表达的检测，胰腺癌内皮细胞和正常内皮细胞的miRNA的表达差异将加以标准化比较。差异表达超过20倍的将筛选出来，可以命名为待选AngiomiRs，共计14种。剔除已经被证实与肿瘤的血管生成调控有关的miRNAs外，因此本研究明确筛选出差异化表达的目前尚无研究的miR-182和 miR-200c作为AngiomiRs，已用于进一步的活性实验。