NETs中的DNA诱导间充质干细胞焦亡的分子机制及其在损伤修复中的意义

The powerful regeneration effect of mesenchymal stem cells (MSCs) is critical in the repair of tissue damage, but the low survival rate and short survival time remain the main obstacle for the application of MSCs. Previous studies have reported that increased neutrophil extracellular traps (NETs) further induce tissue cell death, and NET frame part, DNA, might take the leading role. Further studies have found that DNA could induce pyroptosis of tissue cells such as epithelial cells and endothelial cells by the activation of AIM2-Caspase-1-GSDMD pathway. However, whether DNA is able to induce MSC pyroptosis has not been elucidated. Our unpublished studies have found that sterile drainage fluid from wounds after surgery contained plenty of NETs was able to induce MSC death by activation of caspase-1. Therefore, we hypothesize that DNA, the major component of NETs, induces pyroptosis of MSCs via AIM2-Caspase-1-GSDMD pathway, leading to reduced survival of MSCs and preventing them from repairing damaged tissues. In this study, we will block the pyroptosis of MSCs by targeting DNA-activated AIM2 inflammasome, either through degradation of NET DNA or through knocking out AIM2 genes in MSCs. The study will provide new ideas and methods for improving the repair effect of MSC treatment.

间充质干细胞（MSC）具有强大的修复作用，部分研究发现，外源性MSC在损伤局部存活率低、存活时间短，是限制其发挥作用的主要原因。研究表明，损伤造成的炎症微环境中的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）增多，进一步诱导组织细胞死亡，其骨架成分DNA可能发挥重要作用。进一步发现DNA活化AIM2-Caspase-1-GSDMD信号通路，诱导上皮细胞、内皮细胞等组织细胞焦亡，但是此通路是否诱导MSC焦亡，影响组织修复，尚未见报道。本课题组研究发现，富含NETs的术后伤口的无菌引流液活化Caspase-1，引起MSC死亡。因此我们推测：炎症微环境中NETs的DNA，通过AIM2-Caspase-1-GSDMD信号通路诱导MSC焦亡，阻止其修复作用。本研究以DNA激活AIM2炎症小体为靶点，通过清除NETs中DNA、敲除MSC中AIM2基因这两种方法，阻止MSC焦亡，为提高MSC发挥修复作用提供新思路。

脓毒症是人类危重症死亡的主要原因，大量中性粒细胞释放的中性粒细胞诱捕网（NETs）在其发生发展中起关键作用。间充质干细胞（MSC）具有强大的免疫调节和修复作用，但是既往报道中MSC对脓毒症的疗效良莠不齐，原因之一是外源性MSC在体内存活率低、存活时间短，限制其发挥作用，具体机制尚不明确。本课题研究发现，（1）NET-DNA诱导MSC死亡。具体表现为NETs刺激MSC释放LDH，使MSC与PI结合率升高；DNase I预处理NETs后，MSC释放LDH和与PI的结合率降低。（2）ctDNA和poly(A:T)诱导MSC死亡的方式是焦亡。表现为ctDNA和poly(A:T)刺激后MSC变大变圆，其中cleaved-caspase-3和GSDME-N表达升高；另外，ZVAD抑制caspase活性后，ctDNA和poly(A:T)诱导的MSC中GSDME-N表达降低，MSC释放LDH和与PI的结合率降低。（3）ctDNA和poly(A:T)通过cGAS诱导MSC焦亡。表现为ctDNA和poly(A:T)刺激后cGAS、p-STING、cleaved-caspase-3和GSDME-N表达增高，乙酰化酶抑制剂MS-275抑制cGAS活性后，p-STING、cleaved-caspase-3和GSDME-N表达降低，同时MSC释放LDH和与PI的结合率降低。（4）DNase I联合MSC治疗后脓毒症小鼠的生存率升高。在LPS诱导的小鼠脓毒症模型中，接受腹腔注射DNase I (+6h)和尾静脉注射MSC（+9h）联合治疗的小鼠的生存率明显高于单独MSC治疗小鼠(P＜0.01)。此外，在脓毒症小鼠外周血中发现有大量NETs，其骨架结构DNA通过cGAS-Caspase 3-GSDME信号通路诱导外源输注的MSC焦亡。通过DNase I降解外周血中NET-DNA、阻断cGAS或caspase-3活化均可部分阻止MSC焦亡，提高MSC存活率，从而改善脓毒症小鼠生存率。本研究首次报道MSC存在一种新的死亡方式——焦亡，并解释了微环境中DAMP分子DNA诱导MSC焦亡的机制，为MSC治疗脓毒症的临床转化提供新思路。本研究的不足之处为尚未完成用cGAS-/-和GSDME-/-小鼠来源的MSC治疗脓毒症。