AKT和Wnt11双基因联合骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的机制研究

Acute Myocardial infarction (AMI) is one of the major diseases that damage severely human health. Heart failure post AMI has the poor prognosis and with little effective for traditional therapy. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation become a new method treating for heart failure recently, but still facing the problem of lower rate of differentiation and survival .It has been reported that overexpression of AKT can improve survival of MSCs, and transfection of Wnt 11 gene can induce polarization to myocyte .We designed to choose AMI mice model and set up recombined adreno- associated virus type 9 vector with expression of Wnt 11 and AKT gene. Then it will be transfected to bone marrow mesenchymal stem cell and implanted to infarcted zone. We hypothesised the treatment would improve survival of stem cell and polarization to myocyte, enhance regeneration of myocyte. We wanted to clarify molecular mechanisms of improvement of survival and polarization to myocyte of MSCs from double genes transfection to MSCs by detecting myocardial markers，collagen，infarct size，haemodynamics，cardiac function，angiogenesis，etc.At the same time we want to make sure of the possibility and effectivity of AKT and Wnt11 gene combined with MSCs implantation to AMI.We wish to find a new method to treatment AMI by gene combined with stem cell implantation from the study.

心肌梗死（AMI）是严重危害人类健康的心血管疾病，AMI后心力衰竭预后极差但缺乏有效的治疗手段。骨髓间充质干细胞（MSCs）移植治疗是近年来的研究热点，但是MSCs在梗死心肌中的低存活率及向心肌细胞的低分化率是制约其疗效的瓶颈。研究表明AKT基因过表达可促进MSCs存活，转染Wnt11基因可促进MSCs定向分化为心肌细胞。据此，本课题拟采用小鼠AMI模型，构建表达AKT和Wnt11双基因的重组AAV-9载体，转染MSCs并移植至梗死心肌，进而提高MSCs的存活率及其向心肌细胞分化能力，促进心肌再生；通过检测心肌标志物、胶原蛋白、心梗面积、血液动力学、心功能、新生血管等指标，阐明双基因转染促进MSCs存活并定向分化为心肌细胞的分子机制，明确AKT和Wnt11双基因联合MSCs移植治疗AMI的可行性及有效性，为基因联合干细胞移植治疗AMI提供新的思路和方法。

本研究拟通过转染AKT 基因促进骨髓间充质干细胞（MSCs）存活，转染Wnt11基因促进MSCs 定向分化为心肌细胞，改善MSCs移植治疗心肌梗死（AMI）的效果。本研究选取4-8周龄C57BL/6J雄性小鼠，培养小鼠骨髓间充质干细胞，培养过程中发现培养至第2、3代时，细胞纯度较好，可达到90%以上,但细胞生长缓慢，经过查阅文献和反复摸索，最终确定20%的血清浓度下BMSC生长状况最佳。研究发现重组腺相关病毒对小鼠骨髓间充质干细胞转染率极低，难以达到后续试验的转染要求，查阅相关文献后，决定更换病毒载体为慢性病毒。用构建好的慢病毒载体LV-GFP、LV-AKT、LV-Wnt11转染小鼠骨髓间充质干细胞，并用Western Blot检测目的基因相应蛋白的表达，发现单基因转染小鼠骨髓间充质细胞的转染率高。AKT基因过表达具有抗氧化应激作用，Wnt基因转染干细胞后用Western Blot检测Wnt基因表达的情况，发现实验组与对照组无明显差异，因为Wnt11蛋白是分泌性蛋白，则改进实验方法为在细胞培养基中加入Wnt11蛋白，浓度为150ng/ml。用细胞免疫荧光方法可以观察到转染Wnt11基因以及上清液含有Wnt11蛋白的细胞组有心肌细胞标记蛋白阳性细胞，但未发现搏动细胞，为求进一步明确携带双基因的小鼠骨髓间充质干细胞是否可以分裂成心肌细胞，故让小鼠心肌细胞与间充质干细胞共培养，可以观察到部分干细胞内出现肌丝样物质。体内研究建立了小鼠的AMI 模型，构建表达AKT和Wnt11双基因的重组慢病毒载体，靶向转导小鼠心肌，进而建立功能性和稳定的侧支循环、改善缺血心肌的灌注和功能；通过检测促血管生长因子表达、心梗面积、血流、心功能、新生血管密度等指标，阐明双基因转导促进血管新生的分子机制，明确基因靶向干预治疗的有效性及可行性，为基因靶向治疗小鼠AMI提供新的思路。