植物ATR蛋白调控DNA损伤反应的机理

All organisms evolved with sophisticated DNA damage repair system to maintain genome stability. ATR，one of the two major regulators in DNA damage repair system, functions mainly by activating CHK1 and CDC25 and is essential for animal embryo development. However, plants do not have homologues of CHK1 or CDC25. Therefore, it remains elusive how plant ATR regulates DNA damage responses. Although the Arabidopsis atr mutant is hypersensitive to DNA damage, it develops normally, which provides us a good opportunity to systematically study the mechanisms of ATR using genetic approaches. In this proposal, we will perform genetic screens for the suppressors of atr mutant using both EMS mutagenesis and activation tagging approaches. After cloning the mutated genes by next-generation sequencing or TAIL-PCR, we will study how ATR regulates these genes in terms of protein-protein interaction, phosphorylation, protein degradation and gene expression. We will further study how these genes regulate DNA damage responses. So far, we have got about 200 suppressors through initial screens. This proposal will help to identify key genes in the ATR pathway, which will not only elucidate how plant ATR functions, but also reveal plant unique DNA damage repair mechanisms.

所有生物都进化了精细的DNA损伤修复系统以维持基因组的稳定性。ATR是DNA损伤修复系统中最核心的两个调控蛋白之一，主要通过激活CHK1和CDC25来发挥作用，对动物的胚胎发育是必需的。但是植物缺少CHK1和CDC25的同源基因，因此植物ATR的作用机理依然是谜。拟南芥atr突变体虽然对DNA损伤非常敏感，却能正常发育，这为利用遗传学的手段系统地研究ATR的作用机理提供了有利条件。本项目将采用EMS诱变法和激活标签法筛选atr突变体的抑制子，分别用二代测序法和TAIL-PCR法克隆突变基因，从蛋白质相互作用、蛋白质磷酸化、蛋白质降解、基因表达等方面研究ATR如何调控这些突变基因，并进一步研究这些基因参与DNA损伤反应的分子机理。目前我们已经初步筛选到约200个抑制程度不一样的抑制子。本项目将有助于鉴定植物ATR通路中的关键基因，阐明ATR的作用机理，揭示植物特有的DNA损伤修复机制。

ATR是DNA损伤修复系统中最核心的两个调控蛋白之一，主要通过激活CHK1和CDC25来发挥作用，对动物的胚胎发育是必需的。但是植物缺少CHK1和CDC25的同源基因，因此植物ATR的作用机理依然是谜。拟南芥atr突变体能正常发育，但是对DNA损伤试剂羟基尿（HU）非常敏感。本项目采用EMS诱变法和激活标签法两种策略筛选atr突变体的抑制子，以解析ATR的作用机理。主要结果如下：（1）突变泛素E3连接酶FBL17能够抑制atr和wee1突变体对HU的超敏感性。（2）WEE1能够与FBL17相互作用。（3）FBL17第99位的丝氨酸残基能够被WEE1磷酸化。（4）磷酸化的FBL17进一步被泛素化，并通过26S蛋白酶体被降解。（5）FBL17与CDK抑制蛋白KPR7相互作用，促进KRP7的降解。（6）过量表达KRP7能够抑制atr和wee1突变体对HU的超敏感性。（7）人的WEE1能够与FBL17的同功能蛋白SKP2相互作用，并且磷酸化SKP2，从而促进SKP2的降解，表明这一机制在动物中是保守的。（8）突变MAC复合体亚基PRL1和CDC5也能抑制atr和wee1突变体对HU的超敏感性。（9）WEE1与PRL1相互作用。（10）PRL1第145位的丝氨酸残基能够被WEE1磷酸化。（11）磷酸化的PRL1进一步被泛素化，并通过26S蛋白酶体被降解。（12）HU处理和突变PRL1导致很多细胞周期相关基因发生内含子保留，从而延缓细胞周期进程。我们的研究发现了WEE1的新底物FBL17和PRL1，表明WEE1除了通过直接抑制CDK来诱导细胞周期停滞外，还能通过负调控FBL17和PRL1间接地抑制CDK。因此，我们发现了ATR/WEE1模块调控细胞周期的新机制。在该项目的资助下，在PNAS发表论文一篇（第一标注），投稿到EMBO Journal一篇（第一标注，同行审稿中），投稿到Nucleic Acids Research一篇（第一标注，已收到审稿意见，正在修改），培养了博士后2名、博士研究生2名和硕士研究生3名。