植物源杀螨活性物EO对朱砂叶螨驱避活性的分子机制

The use of push-pull strategies via the active compounds from plants in integrated pest management has been the object of considerable global research interest and become an important direction for research. However, due to the limit of genome information of mites, especially of the olfactory, the molecular mechanism in this field is scarcely explored. Based on the previous work, this study will be conducted to analyze and identify the odorant binding proteins (OBPs) genes from Tetranychus cinnabarinus by full-length transcriptome sequencing, and detect the expression differences of OBPs genes when T. cinnabarinus population were treated with ethyl oleate (EO) by qPCR. Through fluorescence competition test, the potential target protein of EO which has strong binding ability with EO will be screened out. To investigate the binding characteristics of this protein and EO, homology modeling and molecular docking techniques are performed and the key binding sites also can be predicted. In addition, the distribution of the potential target protein will be explored by immunohistochemistry analysis and Western blotting. The expected results will not only contribute to deeply understanding the molecular mechanism of mite repellents, but also provide the basis for exploring some new targets and realizing the industrialization and commercialization of this compound.

利用植物源杀虫活性物质通过“推-拉”策略防治害虫是目前国内外害虫生物防治的研究热点之一。然而，因受限于害螨基因组学信息的匮乏，特别是嗅觉相关基因信息，致使该领域分子机制的研究甚少。本研究在前期研究的基础上，通过全长转录组测序分析，鉴定朱砂叶螨气味结合蛋白（OBPs）编码基因，利用荧光定量PCR技术检测植物源杀螨活性物油酸乙酯（EO）对其基因表达量的影响；通过荧光竞争结合试验，探究EO与朱砂叶螨OBPs的结合能力，筛选EO可能作用靶点蛋白；采用同源建模与分子对接技术模拟分析该蛋白与EO的识别与结合特性，预测其关键结合位点；并通过蛋白免疫印迹和免疫组化技术对该靶点蛋白进行免疫组织定位。预期研究结果不仅能有助于深入理解活性物质对害螨的驱避机制，还可为挖掘有效新作用靶点以及实现该化合物的产业化和商品化提供技术与理论支撑。

利用植物源杀虫活性物质通过“推-拉”策略防治害虫是目前国内外害虫生物防治的研究热点之一。然而，因受限于害螨基因组学信息的匮乏，特别是嗅觉相关基因信息，致使该领域分子机制的研究甚少。本项目以朱砂叶螨为研究对象，运用转录组学、分子生物学等手段，开展了植物源杀螨活性物质EO对朱砂叶螨驱避活性的分子机制研究。研究结果表明：1）朱砂叶螨全长转录组和比较转录组测序结果显示，朱砂叶螨与其近缘物种二斑叶螨Tetranychus urticae序列具有较高匹配率（96.61%）；筛选鉴定出40条气味和嗅觉/化学感受相关基因。2）化合物EO显著影响朱砂叶螨体内气味结合蛋白及化学感受相关蛋白基因的表达量；气味结合蛋白基因TurtOBP1（tetur10g04040）在经EO处理后15 min时达到最大上调表达，在45 min 时达到最高下调表达；在检测的化学感受相关蛋白中，除tetur04g06520和tetur04g03110外，所有基因表达量在EO处理15 min时都出现最大上调表达，其中tetur01g16734和tetur31g00830基因在15 min时表达量上调相对较大，且在45 min时下调也最为显著。3）通过原核表达、纯化获得了两个朱砂叶螨高纯度重组气味结合蛋白TurtOBP1和TurtOBP2；微量热涌动结合试验显示EO与TurtOBP1的结合能力明显高于TurtOBP2，EO与两个蛋白的解离常数KD值分别为32.3 和114.0 μM。结合基因表达量和蛋白结合能力测试结果都表明朱砂叶螨气味结合蛋白TurtOBP1为EO可能作用靶点蛋白。4）EO可能作用靶点蛋白与EO的分子动力学实验模拟显示EO在50 ns后形成了相对稳定的构象，EO的长烷基链变成“环行”，从蛋白口袋底部伸向口袋上方边缘，烷基链形成分子内部疏水作用的同时，与蛋白的氨基酸残基Y139、I148、E147、W132、Y186、H165、M190、I194、I200、W77、L83和I161形成广泛疏水作用。5）EO可能作用靶点蛋白TurtOBP1在不同发育历期的朱砂叶螨中的表达量有差异，其中在幼螨和若螨中的表达水平相对较高。研究结果不仅能有助于深入理解活性物质对害螨的驱避机制，还可为挖掘有效新作用靶点以及实现该化合物的产业化提供技术支撑。