大肠杆菌YfiF蛋白对DNA复制起始的调控机制

Initiation of chromosomal replication is tightly regulated in Escherichia coli.First, the DnaA protein unwinds the double-stranded DNA at the replication origin (oriC), and then DnaB helicase,SSB,DNA PolIII are recruited at the open site and start replication. The analogous control of replication initiation has been found in Eukaryotic cells. We found that deletion of the yfiF gene delayed initition of replication; on contrast,overexpresion of the YfiF protein led to an early initition of replication. However, the mechanisms behind the findings have remained unclear. The project has been designed: to determine functional domains of YfiF; to investigate if YfiF is a ribosome-associated protein and if YfiF is a RNA methytransferase; to understand what the functions of YfiF are. Finally we aim to characterize YfiF-mediated control of initiation of replication using genetic and molecular biological methods. Uncontrolled replication leads to different diseases including cancers as a result of genome instability. Therefore, the project will shed light on the regulation of DNA replication of both normal and cancer cells.

大肠杆菌（Escherichia coli）染色体复制起始是个严格调控的细胞过程。首先，DnaA在复制原点（oriC）打开双链DNA，之后，DnaB解旋酶、SSB和DNA 聚合酶III组装后便启动复制。真核细胞也有相似的复制起始调控机制。我们发现yfiF基因的删除引起复制起始的推迟；过表达YbfE蛋白导致复制起始的提早发生；软件分析发现YfiF蛋白预测功能是个RNA甲基转移酶。本项目以揭示以上生命现象背后机制为目标，确定YfiF蛋白的功能域；探索YfiF与核糖体的相互作用机制；检测YfiF是否是个RNA甲基转移酶；探明YfiF蛋白介导的复制起始调控机制，鉴定YfiF生物学功能。 染色体异常复制会降低基因组的稳定性，并由此引发细胞癌变或发育缺陷。所以，本项研究不仅在生命科学基础研究中具重要意义，而且在医学研究和临床应用方面也具有借鉴和指导作用。

大肠杆菌（Escherichia coli）染色体复制起始是个严格调控的细胞过程而真核细胞也有相似的复制起始调控机制。本项目探索了大肠杆菌功能未知的YfiF蛋白对DNA复制起始及细胞周期的影响。发现YfiF蛋白是DNA复制起始正调控因子。YfiF不与复制起始相关蛋白DnaA，DnaB，DnaC和Dam相互作用。通过凝胶迁移分析发现纯化的YfiF与复制起始原点oriC DNA在体外没有直接的相互作用，说明YfiF不是通过直接与oriC相互作用来影响复制起始。经测定单个细胞总蛋白和复制起始蛋白DnaA的含量，发现YfiF通过影响单个细胞总蛋白含量而影响DnaA含量，后者直接影响染色体复制起始时间。.软件预测说明YfiF可能是一个tRNA/rRNA甲基转移酶。本项目发现10种核糖体相关基因突变体都能引起DNA复制起始的滞迟，且YfiF在这些单突变体中的过表达都能恢复其DNA复制为野生型式样。对比双突变体的复制式样，发现YfiF对复制起始的影响是独立于核糖体蛋白Sra，RpsF，RpsO和RpsT，也与核糖体相关蛋白RimJ，DbpA，CsdA和YfiA无关。然而，yfiF缺失突变加重了Δrmf和Δhpf突变体原有的复制起始滞迟和生长速率慢的表型，表明YfiF在功能上与RMF和HPF互补。为了探讨YfiF的RNA甲基转移酶功能，把ΔyfiF突变转导至tRNA/rRNA甲基转移酶基因删除突变体，并分析其复制式样，发现ΔyfiFΔtrmL双突变体的复制式样明显区别于其单突变体，在ΔtrmL细胞中过表达YfiF能够恢复为野生型复制式样，说明YfiF与RNA甲基转移酶TrmL功能相关。细菌双杂交实验结果显示YfiF与16s rRNA甲基转移酶RsmC有直接的相互作用。高效液相色谱（HPLC）分析发现YfiF是大肠杆菌tRNA的IV型甲基转移酶。用位点特异性突变技术分析发现YfiF蛋白α1、β1和β2结构域可能是YfiF的关键功能域。.此外，我们从以下3个方面拓展了项目研究内容：（1）揭示一种依赖大肠杆菌细胞周期的基因表达空间调控新机制；（2）发现大肠杆菌二组分体蛋白BaeR缺失导致复制起始提早发生；（3）纳米合成材料可以杀死∆dksA突变细胞。这些发现对阐明大肠杆菌染色体复制起始和基因表达调控机理有科学意义，对真核细胞周期的研究有指导和借鉴作用。