大肠杆菌YbfE蛋白介导的DNA修复机制

The Escherichia coli cells have several pathways of DNA repair to maintain the integrity of genome. The eukaryotic cells also have similar mechanisms to repair damaged DNA. We found that deletion of the ybfE gene which is not yet clarified funtionally and overexpression of the YbfE protein led to DNA damage. The YbfE protein was also found to co-localize with the chromosomal DNA. The ybfEdinI and ybfEdinB double mutants were more sensitive to UV relative the single mutants. Interestingly, the replication initiator DnaA affected expression of the ybfE gene and the ybfE promoter region contained a LexA-binding site. However, the mechanisms behind the findings have remained unclear. Here we plan to characterize YbfE-mediated DNA repair pathways using genetic, biochemical and molecular biological methods，to understand why YbfE co-localizes with DNA in vivo and what the fuctions of YbfE are. It has also been designed to investigate interaction of DnaA and LexA, and roles of such interactions in control of ybfE gene expression. DNA damage, repair defeciencies, and uncontrolled replication leads to different diseases including cancers as a result of genome instability. Therefore, the project will shed light on the regulation of DNA repair pathways of both normal and cancer cells.

大肠杆菌（Escherichia coli）细胞有几种不同DNA修复途径，确保其基因组的稳定性，真核细胞也有相似的DNA修复机制。我们发现功能尚不清楚的基因，ybfE删除或过表达YbfE蛋白都会引起DNA损伤；YbfE蛋白与染色体DNA共定位；ybfEdinI和ybfEdinB双突变体对UV更敏感；复制起始蛋白DnaA影响ybfE基因表达, ybfE启动子含有LexA结合位点。本项目以揭示以上生命现象背后机理为目标，通过遗传学和生物化学与分子生物学手段，阐明由YbfE介导的DNA 修复机制、YbfE与染色体共定位的生物学意义、鉴定YbfE生物学功能；研究DnaA和LexA对ybfE基因表达的协同调控机制。DNA损伤、修复缺陷、DNA异常复制会降低基因组的稳定性，并由此引发细胞癌变或发育缺陷。所以，本项研究不仅在生命科学基础研究中具重要意义，而且在医学研究和临床应用方面也具有借鉴和指导作用。

基因组稳定性对于维持正常细胞周期至关重要，能够确保每次细胞分裂后，其两个子细胞得到完整的一套基因组，保证遗传的稳定性。在此研究之前，dnaM（原ybfE在此依据其功能被命名为 dnaM）基因及其产物的功能尚不清楚。. 按项目计划任务书，实施研究发现：缺失dnaM基因导致染色体复制异常，并提升自发突变率和uvrB基因表达，且对UV敏感；当缺失复制纠错酶DnaQ时，DnaM的复制纠错作用尤为明显。这些结果说明DnaM蛋白是维持基因组稳定性的辅助因子。实验显示DnaM：（1）在DNA复制阶段与染色体共定位；（2）从3端消化DNA，具有35外切酶活性；（3）切割闭合双链DNA中一条链而松弛处于超螺旋状态的质粒DNA。突变分析发现: 在19个突变中，DnaMK38I、DnaMK51E、DnaMR52G、DnaMK56E和DnaMR76G突变蛋白的功能有明显改变，不再影响染色体复制而 DnaMR92G突变蛋白的功能有所增强；有趣的是，DnaMK51E不再与染色体共定位，DnaMR92G仍与染色体共定位，说明DnaM是通过与染色体共定位来发挥作用；DnaMK51E和DnaMR92G突变蛋白对降解DNA的能力均有不同程度下降，但提升其松弛超螺旋DNA的活性，说明这两个氨基酸位点对于保持DnaM功能完整性是必要的。体内外实验证明DnaM与DnaN有相互作用，说明DnaM通过与DnaN的相互作用来与正在复制的染色体共定位。. 研究还发现缺失dnaM基因明显提升dnaM本身的表达，而过表达DnaM实施相反的效应，这个过程需要dnaM启动子区域的LexA-box。这些结果显示dnaM基因表达是由DnaM蛋白自我调控的，并需要LexA-box的协助。. 综上所述，自我调节表达的dnaM基因产物DnaM，通过与DnaN的相互作用定位于复制叉，并从3末端把新合成的错误脱氧核苷酸切下来，帮助DNA聚合酶的3末端向5末端外切酶活性以保证复制正确性；同时，DnaM具有的可能拓扑酶活性辅助拓扑酶松弛超螺旋DNA，确保复制叉的顺利前行。因此，DnaM介导的作用机制是确保基因组稳定性的辅助途径。