染色体复制负调控因子datA在细胞周期中的作用

大肠杆菌（Escherichia coli）datA是个DNA复制负调控因子，它以高亲和性结合复制起始蛋白质DnaA。额外datA延缓DNA复制起始和细胞分裂，说明datA不仅抑制复制起始而且也影响细胞分裂。高考贝datA会杀死野生型细胞。本项研究拟用NK1098噬菌体，把Tn10随机插入在大肠杆菌染色体任意位点上，系统筛选datA抑制突变体；并通过了解datA抑制突变体表型、作用位点以及被干扰基因功能来研究datA与其他蛋白的相互作用，由此阐明datA在细胞周期中的作用并探索复制与其他细胞过程的协调机理。DNA复制与细胞周期的其他环节密切协调，DNA复制差错或异常（过多或过少）复制会降低基因组稳定性，并由此引发细胞癌变或发育缺陷。该项研究不仅在生物学研究中具重要的理论意义，而且在医学研究和应用方面也有广阔的前景。特别是在癌症研究、治疗和诊断等方面是不可忽视的重要领域。

本项研究用λNK1098噬菌体在大肠杆菌染色体上进行随机突变后，以高拷贝datA质粒pBR322-datA来转化，并筛选出能够抑制高拷贝datA致死效应的突变体。datA是1kb的DNA序列可以结合大量的复制起始蛋白DnaA，因此，datA的功能是通过降低DnaA蛋白的可用量来实现的。本研究筛选出pncB、purL、xapR、glgX、recE和recT等6个datA抑制突变体，称之为datAS突变体。PncB蛋白控制质粒拷贝数，PurL和XapR与核苷酸代谢有关，GlgX与糖代谢相关，RecE和RecT与同源重组相关。分析发现datAS突变体生长较慢，复制起始较早；过表达GlgX和PurL引起细胞较快生长；datASΔdatA双突变体除了ΔdatApcnB外生长明显比单突变体慢。构建datASdnaATS双突变体并对其表型分析发现，datAS突变并不影响dnaA204、dnaA46、dnaA5和dnaA295突变体的温度敏感，说明datAS所表达蛋白与复制起始蛋白DnaA没有相互作用。发现recT和recE突变体能够抑制高拷贝datA的致死效应，recE突变细胞中有RecT表达，并pBR322-datA整合于染色体上，说明recT和recE细胞中有同源重组。recT和recE突变降低dnaATS的温度敏感性,说明RecT和RecE与DnaA有相互作用。用温度敏感dnaC2突变在42oC（dnaC2在42oC失活而不能完成复制起始）培养来抑制染色体复制起始时，缺失datA或过表达DnaA会积累无核细胞，说明缺失datA或过表达DnaA增强细胞分裂；而额外datA会彻底抑制无核细胞的形成。datA的缺失会抑制细胞分裂基因ftsZ84和ftsI23突变的温度敏感性。这些结果说明datA对细胞分裂有调控作用。同时，我们从以下2个方面拓展了项目研究内容：（1）探讨MiniR1-1质粒对细胞周期的影响，发现MiniR1-1质粒延缓细胞分裂，测定了MiniR1-1的基因组序列，并探讨了该质粒影响细胞分裂的机制；（2）研究AspC介导的代谢对细胞周期的调控作用，发现删除aspC基因引起细胞周期的滞迟，而过表达AspC具有相反的效果；AspC介导的天冬氨酸代谢改变每个细胞的DnaA量。这些发现对阐明大肠杆菌细胞周期的调控机理有科学意义。