“miR-147a靶向调控PDPK1”在曲克芦丁干预电离辐射损伤中的机制研究

At present, the target and signal pathway of radioprotection for Troxerutin (TRT)are not clear, which limits its further clinical application. Previous studies have shown as follows. ①TRT showed a protective effect by activating PI3K/AKT and reducing the activation of miR-147a induced by radiation damage; ②Overexpression of miR-147a inhibited the expression of PDPK1; ③Silencing miR-147a up-regulated the expression of PDPK1; ④PDPK1 3'UTR had binding sites for miR-147a.These results suggest that TRT may regulate the activity of PDPK1 by down regulating miR-147a and then activate the AKT to enhance the radioprotective effect Cell and animal model of radiation damage will be established in this project. The method of molecular biology will be used to study the following problems. ①Whether miR-147a can regulate PDPK1 3'UTR. ②The mechanism of reducing radiation damage by TRT through miR-147a/PDPK1/AKT will confirm that miR-147a is the key molecule of TRT in radiation damage. The aim of this study is to provide a new target and target relationshipfor the search and application of radio-protective drugs by studying the mechanism of TRT intervention on radiation injury.

曲克芦丁（TRT）的辐射防护作用已明确，而其作用的靶点和信号通路尚不明确限制其在临床进一步扩展应用。前期研究显示：①TRT通过激活PI3K/PDPK1/AKT和抑制miR-147a的表达干预辐射损伤；②过表达miR-147a抑制PDPK1基因表达；③沉默miR-147a上调PDPK1的基因表达；④PDPK1 3'UTR存在miR-147a的结合位点。以上结果提示，TRT可能通过上调miR-147a负性依赖的PDPK1的表达，进而激活AKT，增强辐射防护作用。本课题拟建立辐射损伤细胞和动物模型，采用分子生物学的方法，研究：①miR-147a是否靶向调控PDPK1 3'UTR；②TRT通过miR-147a/PDPK1/AKT减少辐射损伤的机制，确立miR-147a是TRT干预辐射损伤的关键分子。通过研究TRT干预辐射损伤的机制，为辐射防护靶药物的寻找和应用提供新靶点和新型靶关系。

曲克芦丁(Troxerutin, TRT) 系芦丁经羟乙基化制成的黄酮化合物，我们通过细胞和动物实验，揭示了其显著的辐射防护作用，TRT的辐射防护作用已明确，但是其作用的靶点和信号转导途径尚不明确, 所以，本课题拟对TRT的辐射防护作用的靶点进行研究，进行了以下三个方面的研究：(1) 确认miR-147(a)与PDPK1-3'UTR 的特异性结合;(2) 研究TRT是否上调miR-147(a)负性依赖的PDPK1/AKT的表达及机制;（3）探讨TRT是否经过miR-147(a)/PDPK1/AKT增强辐射防护作用;（4）研究miR-147(a)/PDPK1/AKT在TRT改善小鼠辐射损伤中的作用。通过研究，得到如下结果：1. PDPK1-3´UTR存在miR-147(a)的直接靶作用位点，PDPK1与miR-147之间存在靶向调控关系。2.与辐射组相比，药物组TRT 10μg/mL能显著下调辐射后激活产物miR-147(a)、JNK的磷酸化水平，上调PDPK1 mRNA和蛋白、AKT蛋白的磷酸化水平。与对照组比较，转染miR-147(a) inh、PDPK1 sh、AKT sh后，或过表达pre-miR、PDPK1、AKT后，TRT干预miR-147(a)、PDPK1 mRNA和PDPK1蛋白、p-AKT蛋白、p-JNK蛋白表达的能力明显降低，或无显著性差异。3.以小鼠肝脏、胸腺为研究对象，C57BL/6N小鼠（WT）被辐射后，TRT 10 mg/kg组的PDPK1蛋白、p-AKT蛋白表达明显高于单纯放射组，p-JNK蛋白则相反；对于pre-miR-/-小鼠，与辐射组比较，TRT照射组对PDPK1、p-AKT、p-JNK蛋白调控无显著性差异（胸腺组织，辐射后，与WT鼠比较，TRT组上调PDPK1蛋白的能力有差异但明显减弱）。与辐射组比较，10 mg/kg TRT改善pre-miR-/-小鼠肝脏、胸腺组织病理学、抑制组织细胞凋亡、激活PDPK1无显著性差异（IF）（胸腺组织，辐射后，与WT鼠比较，TRT组上调PDPK1蛋白的能力明显减弱）。本课题对TRT的辐射防护作用靶点的研究，为解释TRT的辐射防护作用提供依据，为其他黄酮类化合物的辐射防护分子机制研究提供借鉴，并为其下一步用于临床提供基础数据，对提高我国临床辐射损伤治疗和减少肿瘤放疗副作用具有重要意义。