Aqapoirn1介导恶性胸腔积液胸膜肿瘤淋巴管生成 的分子机制的研究

Malignant pleural effusion(MPE) is a common complication of advanced tumor. It can decrease overall survival with tumor patients. We previously found that expression of Aqaporin1(AQP1) in the pleura with lung Adenocarcinoma induced MPE was high augmentation. Besides AQP1 was closely associated with lymphangiogenesis. Using RNA interference and lipofectamine transfection, we will up-regulate and down-regulate the expression of AQP1, and observe activity of PI3K/Akt/mTOR and MAPK/ERK signaling pathways and expression levels of VEGF-C. We also explore effects of AQP1 on lymphatic endothelial cells by three-dimensional lymphangiogenesis assay. Using CHIP technology, we explore target genes interact with AQP1 and molecular mechanisms of lymphangiogenesis in pleural tumor with MPE. This subject will dynamically studies AQP1 in the cells, animals and clinical specimens, clarifies the relationship between AQP1 and the lymphangiogenesis of pleural tumor with MPE. And we will explore the mechanism of MPE formation from the new perspective of lymphangiogenesis. Our study will provide a new target point for inhibiting of MPE.

恶性胸腔积液是晚期肿瘤患者常见并发症，一旦合并生存期明显缩短。申请者前期研究发现，Aqaporin1(AQP1)在肺腺癌致恶性胸腔积液胸膜肿瘤中高表达，且与淋巴管生成密切相关。本课题拟采用RNA干扰和脂质体转染技术，分别上调和下调肺腺癌细胞AQP1表达后，观察对PI3K/Akt/mTOR及MAPK/ERK通路活性和VEGF-C表达的影响；利用三维淋巴管形成实验检测AQP1对淋巴管内皮细胞的作用；使用CHIP技术探寻与AQP1相互作用的靶基因，探讨AQP1促进恶性胸腔积液胸膜肿瘤淋巴管生成的分子机制。本课题拟在细胞、动物及临床标本中对 AQP1进行动态研究，揭示其与胸膜肿瘤淋巴管生成的关系。从淋巴管生成这个新视角，探讨恶性胸腔积液分子形成机制，为抑制临床恶性胸腔积液提供新靶点。

恶性胸腔积液是晚期肿瘤患者常见并发症，一旦合并生存期明显缩短。本课题体外研究采用RNA干扰和脂质体转染技术，分别上调和下调人肺腺癌细胞株NCI-H1299 AQP1表达，成功构建AQP1敲除及过表达的肺腺癌细胞AQP1-KD-NCI-H1299及AQP1-OE-NCI-H1299。体外缺氧条件下培养后，RT-PCR及WB检测HIF-1α及淋巴管生成的重要标记VEGF-C的表达，提示敲除AQP1基因后的AQP1-KD-NCI-H1299细胞VEGF-C mRNA及蛋白表达均下调（P<0.001, P=0.016），反之，过表达AQP1基因后AQP1-OE-NCI-H1299细胞VEGF-C mRNA及蛋白表达均上调（P=0.002, P=0.007）。同时，体外淋巴管成形实验结果提示，随着AQP1及VEGF-C浓度的增加，免疫荧光镜下观察人淋巴管内皮细胞HLEC形成的淋巴管数目增多，共聚焦定量图像扫描仪提示淋巴管面积、管腔骨架长度及管腔成角增多，但各组间未见统计学差异（P>0.05）。进一步的机制部分研究结果提示，AQP1基因敲除后AQP1-KD-NCI-H1299细胞较对照组明显抑制磷酸化p-PI3K，p-mTOR，p-AKT (P=0.006, P=0.038, P=0.003)，而过表达AQP1后AQP1-OE-NCI-H1299细胞较对照组明显激活p-PI3K及p-AKT(P=0.001, P=0.002)。而PI3K抑制剂LY294002干预后，明显阻断了AQP1-KD-NCI-H1299细胞及AQP1-OE-NCI-H1299细胞VEGF-C mRNA（P=0.011, P=0.012）及蛋白的表达（P=0.004, P=0.023）。. 临床标本研究结果，临床收集内科胸腔镜胸膜转移瘤组织标本52例，其中非小细胞肺癌伴恶性胸腔积液胸膜组织标本34例，良性胸腔积液胸膜组织标本18例。免疫组化，RT-PCR及WB检测AQP1表达，恶性胸腔积液胸膜组织AQP1表达较良性胸腔积液胸膜组织明显增高（P＜0.01），提示AQP1可能参与了恶性胸腔积液胸膜转移瘤的形成。进一步我们探究了AQP1在恶性胸腔积液胸膜转移瘤淋巴管生成的关系。免疫组化结果提示微淋巴管LMVD在恶性胸腔积液胸膜转移瘤组织表达较良性胸腔积液胸膜组织明显升高（P<0.001）。