新母核驱动的生物合成红霉素衍生物的应用基础研究

从极端环境中新分离的嗜盐放线菌YIM90600能够产生红霉素新母核（红霉内酯H），具有独特的分子结构。本项目首先采用新型嗜盐菌培养新技术高效制备新母核，然后添加到通过基因敲除构建成功的不产红霉素母核的红霉素高产菌突变株中，通过生物转化合成系列红霉内酯H衍生物。进一步从该嗜盐菌科斯质粒文库中定位和克隆完整新母核基因簇及内酯环后修饰酶基因，并通过基因簇转移技术在多种链霉菌模式菌中建立新母核及其衍生物的异源合成系统。在该系统中，开展新母核的组合生物合成和分子结构改造，构建一个基于红霉素新母核驱动的异源合成红霉素衍生物的平台技术。本项研究不仅能够生物合成一系列基于新母核的红霉素衍生物，并由于新母核的独特结构和新颖性，从而开创了一条具有原创性的创制第三代红霉素类新药的新方法。另外，本项目对如何挖掘和利用极端微生物细胞工厂合成多样化分子结构能力的类似研究也具有重要的示范意义。

从极端嗜盐环境分离得到的放线多孢菌YIM90600能够产生红霉素新母核（红霉内酯H），具有独特的分子结构。项目首先通过对嗜盐放线多孢菌YIM90600的全基因组测序以及生物信息学分析，发现其中红霉素新母核的生物合成基因簇; 进一步通过发酵产物与基因型的关联分析提示，新型红霉素母核的生物合成可能与YIM90600中的P450氧化酶EryF负责催化的。 从红霉素A高产菌株出发，分别构建eryF和eryBV的同框缺失突变株，同时确定了6-dEB和红霉内酯B的分离检测条件。同源EryF的体外测活实验成功证实了两者均能催化6-dEB转化为红霉内酯B，而在YIM90600来源的EryF的体外测活体系中，还可能有少量的6，18-环氧红霉内酯B生成。 与此同时，我们还向eryF同框缺失突变株回补YIM90600来源的eryF，基因回补菌株能够恢复红霉素A、B、C、D的生物合成，却无法获得红霉内酯H的高产表型。. 为了研究嗜盐放线多孢菌YIM90600中的P450氧化酶EryF的催化机制，我们对比研究了同时大环内酯FK506骨架后修饰过程中P450氧化酶的催化机制，证实了P450氧化酶基因fkbD参与了两条平行的结构修饰途径，对阐明本项目发现的YIM90600来源的eryF基因在形成红霉内酯H的关键作用具有重要的借鉴作用。另外通过对FK506骨架结构C-13位和C-15位的甲氧基侧链合成关键基因在生产菌ZJU01染色体的特定位点进行倍增，显著提高了FK506生产水平。 . 总之，本项目首次阐明了嗜盐放线多孢菌YIM90600中发现的红霉素新母核红霉内酯H的生物合成机制，发现了YIM90600来源的eryF基因编码的P450氧化酶特殊的催化特性，尤其在红霉内酯H 6, 18-环氧烷基化的关键作用。并且通过研究大环内酯FK506骨架后修饰过程中类似P450氧化酶的催化机制，证实了P450氧化酶基因fkbD参与了四电子双平行的骨架后修饰的催化本质，随后通过强化关键酶基因表达显著提高大环内酯抗生素产量。这一新型红霉素新母核红霉内酯H生物合成机制研究为下一步基于新母核红霉内酯的新型红霉素新药创制和组合生物合成研究奠定了重要的科学基础。