马铃薯TALEN基因组定向突变技术体系的建立及在淀粉合成机理研究上的应用

Engineered nucleases, such as Zinc Finger nuclease (ZFN) and Transcription Activator-Like Effector Nuclease (TALEN), have been recently utilized to create high efficient targeted genome modification in model plants and animals. Although nuclease-mediated genome modification has been demonstrated in several plant species, including Arabidopsis, tobacco and rice, it has been indicated that the technology platform has to be customized for each target species based on its genome complexity, polyploidy and suitable transformation tools. In this research, we aim to first establish a high efficient TALEN platform for precise genome mutation in potato. TALENs with high efficacy and sequence specificity will be designed, evaluated and tested taking into account of complexity and polyploidy of potato genome. Customized TALENs will be made to target starch biosynthase genes,such as GBSS, SS and SBE. Through TALEN designing, constructing, espressing,transformation and screening,obtained target gene knockout mutants will be analysis for starch characteristics.to achieve the orientation of the target gene in the potato genome knockout, and provide the basis for the study of the potato starch synthesis mechanism. Modified potato lines can be further followed through traditional breeding for phenotype test in progenies. Completion of the proposed research will establish a new paradigm in potato genetic manipulation for basic and applied research.

通过TALEN等定点修饰核酸酶技术对目标基因组进行精确定位修饰，是下一代生物遗传修饰技术的关键。本研究以TALEN技术体系在马铃薯中的构建为出发点，针对马铃薯基因组结构特性和TALEN组装原理，着重构建高效率、高活性、高特异性、高稳定性的马铃薯TALEN技术平台，优化马铃薯复杂基因组TALEN设计、构建、表达、检测和筛选的最佳方案。在此基础上，针对马铃薯淀粉合成的关键酶，特别是直链淀粉和支链淀粉合成酶，如GBSS、SS、SBE等，构建特异的TALEN表达载体，通过瞬时筛选高效载体，进行马铃薯的遗传转化并筛选出定向突变体材料，实现目标基因在马铃薯基因组中的定向敲除，为研究马铃薯淀粉合成机理提供依据。

通过基因定向编辑技术对目标基因进行精确定位修饰，是下一代生物遗传修饰技术的关键。本项目以马铃薯品种底西芮为对象，开展了TALEN、CRISPR/Cas9及CRISPR/Cpf1基因定向编辑体系的设计、组装构建、活性检测、遗传转化、突变体筛选等研究工作，并取得了预期的研究成果；已发表论文14篇，申请发明专利6项，培养博硕士生8名。我们结合马铃薯基因组结构特性和TALEN 组装原理，着重构建高效率、高活性、高特异性、高稳定性的马铃薯TALEN 技术平台，并开发了基于双RVD文库的TALEN组装系统，可在一步反应中，实现15至19个RVD单元的TALEN表达载体构建，将构建过程缩短至1个工作日，有效简化了构建步骤、降低了实验消耗、提高了组装效率。同时，以绿色荧光蛋白基因GFP为报告基因，建立马铃薯原生质体瞬时表达体系，通过GFP活性检测，评价不同基因定向编辑载体在马铃薯细胞水平的定向剪切活性，快速高效的筛选基因定向编辑载体。另一方面，由于马铃薯遗传背景复杂，在稳定转化植株中还缺乏高效便捷且可靠的检测手段，我们开发了基于单链构象多态性（SSCP）的基因定向编辑突变体筛选技术，可以快速有效的鉴定目标植物基因组单碱基突变结果。鉴于新兴基因编辑技术使用简便，发展迅猛，我们通过联合STU-Cas9和植物病毒载体GVR等不同的策略，在马铃薯中建立了简便高效的CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1基因定向编辑系统，并对其活性进行了验证。最终我们利用完整的TALEN和CRISPR/Cas9基因定向编辑体系，对马铃薯直链淀粉合成关键基因StGBSS，以及支链淀粉合成重要基因StSBEa进行定向敲除，并通过原生质体和遗传转化实现相应基因的定向、精准、稳定敲除，初步鉴定并创制了马铃薯StGBSS基因定向突变的材料。进一步我们将对马铃薯GBSS、SBEa等基因定向突变材料进行性状分析，研究相应基因在马铃薯淀粉合成中的作用，以及对直链淀粉/支链淀粉比例、淀粉链长及结构等性状的影响，淀粉品质变异突变体材料，并确立马铃薯基因定向编辑突变体创制、筛选、鉴定的技术标准，保证基因编辑技术在马铃薯基础研究和育种工作中的有效应用。