坦布苏病毒感染抑制肽的抗病毒作用及机制研究

Huge losses have been caused to the breeding industry of waterfowl by the outbreak and spread of tembusu virus in several provinces since 2010. It’s found that purified E protein domains I and II of tembusu virus expressed in E. coli was able to inhibit virus infection. Because of the high molecular weight and complex structure of the recombinant protein, there may be regions that is unfavorable to exert inhibition. In order to identify the core inhibitory sequences, overlapping peptides covering tembusu virus E protein domains I and II are designed and synthesized artificially; and then, cell infection tests are used to define the peptides which inhibited tembusu virus infectivity (peptide inhibitor); on this basis, antiviral characteristics of peptide inhibitors are analyzed; finally, the inhibition mechanism of peptide inhibitor is clarified by analyzing the impacts of peptides on structure of viron, binding between virus and its receptor, and virus membrane fusion during viral infection. This study will provide a new target for the design of anti-tembusu virus drugs and lay the theoretical foundation for prevention and control of diseases caused by tembusu virus.

2010年以来，坦布苏病毒在我国多省暴发和流行，对水禽养殖业造成巨大损失。本课题组前期工作显示大肠杆菌表达的坦布苏病毒E蛋白结构域I/II蛋白对病毒感染具有抑制作用。由于重组蛋白分子量较大，结构复杂，因此可能存在不利于发挥抑制活性的区域。为了进一步定位E蛋白结构域I/II中抑制病毒感染的核心序列，本项目设计并合成覆盖坦布苏病毒E蛋白结构域I/II并相互重叠的多肽；利用细胞感染抑制试验，鉴定具有抑制作用的多肽（抑制肽）；在此基础上，分析抑制肽的抗病毒特性；最后，研究抑制肽对病毒粒子结构、病毒与细胞受体结合及病毒膜融合的影响，明确其抑制病毒入侵的作用机制。本研究旨在为抗坦布苏病毒药物的设计提供新的研究靶点，并为进一步预防和控制坦布苏病毒病奠定理论基础。

坦布苏病毒（tembusu virus，TMUV）是一种危害鸭鹅的黄病毒属病毒，主要引起患病鸭鹅食欲急剧减退、产蛋量骤降、瘫痪及出血性卵巢炎，给鸭鹅养殖业造成了重大经济损失，并且感染的宿主谱还在不断扩大，已成为危害我国鸭鹅养殖业的重要疫病之一。囊膜蛋白（E）是坦布苏病毒粒子表面主要结构蛋白，在病毒吸附、入胞和膜融合过程中发挥关键作用。本课题从E蛋白结构域II和茎干区鉴定获得两个多肽TP1和TP2，并对它们得抗病毒活性进行了研究。TP1和TP2可显著抑制TMUV感染BHK-21细胞，它们得半抑制浓度分别为14.19 mg/L and 7.64 mg/L。病毒抑制试验结果显示，TP1和TP2可抑制TMUV在多种细胞中的感染，包括CEF、DF-1、DEF等，说明TP1和TP2的抗病毒活性不依赖于细胞类型。此外，TP2还可以抑制TMUV同属的日本乙型脑炎病毒的感染。在坦布苏病毒抗体存在的条件下，TP1和TP2对鸭外周血淋巴细胞中TMUV抗体依赖增强作用（ADE）具有阻断效果。 对TP1和TP2抗病毒机作用机制的研究发现，TP1和TP2可与结合于病毒粒子表面。核酸酶降解实验结果证实TP1与病毒粒子结合后可导致TMUV基因组RNA外逸，造成病毒粒子失活。TP1和TP2与病毒粒子结合后均可干扰TMUV吸附细胞。本课题对坦布苏病毒感染抑制肽进行研究，筛选获得2个有效的抑制肽，并发现抑制肽主要是通过直接灭活病毒粒子和干扰TMUV吸附细胞的方式发挥抗病毒作用，为坦布苏病毒病的抗病毒治疗奠定理论基础。