坦布苏病毒抗体依赖性增强作用及其机制的研究

Tembusu virus is a novel flavivirus emerged in China in recent years. The virus mainly causes egg drop, feed uptake decline and encephalitis like nervous symptoms among domestic fowls including ducks, geese and chickens, causing a huge economic loss of the avian-breeding industry. The antibody-dependent enhancement (ADE) demonstrated in many flaviviruses could result in the deterioration of the diseases and hinder the development and application of vaccines. ADE of Tembusu virus infection was found in mice and ducks. In this research, the mechanisms of ADE will be elucidated from two aspects, extrinsic ADE(eADE) and instrinsic ADE(iADE). In vivo and in vitro models of ADE infection of Tembusu virus will be established, and the effect of different antibody levels to the ADE will be determined. The percentage of cells infected by viruses and the virus replication in infected cells during the ADE infection of Tembusu virus will be measured and compared with the infection without antibody. Then, the receptors which mediated ADE and the ADE-associated antigens of Tembusu virus will be identified. The influences of ADE on the expression of cytokines and molecular signaling events in innate anti-virus immune response will be determined. Our results could provide theoretical basis to the optimization of vaccine design and effective prevention of Tembusu virus.

坦布苏病毒是近年来我国新出现的一种黄病毒属病毒，可引起鸭、鹅和鸡等家禽采食量和产蛋率显著下降，出现脑炎样神经症状，对我国家禽养殖业造成严重的经济损失。抗体依赖性增强作用（ADE）在多种黄病毒属病毒中都存在，会导致疾病恶化，并影响疫苗的开发和应用。已发现坦布苏病毒在小鼠和鸭体内存在ADE现象。本项目拟建立坦布苏病毒ADE感染的体内、体外发生模型，研究不同抗体水平对ADE的影响，比较ADE感染后细胞感染率和病毒增殖情况的变化，鉴定与ADE感染相关的受体类型和抗原，探究ADE感染对宿主先天性抗病毒免疫反应的影响，从外部ADE和内部ADE两方面阐明坦布苏病毒ADE的发生机制，为优化疫苗设计，有效防控禽坦布苏病毒病提供理论依据。

坦布苏病毒是一种新型黄病毒属病毒，可引起家禽采食量和产蛋率显著下降，出现脑炎样神经症状，对我国家禽养殖业造成严重的经济损失。抗体依赖性增强作用会导致疾病恶化，并影响疫苗的研发和应用。已发现TMUV在小鼠和鸭体内存在ADE现象。但鸭的TMUV-ADE感染发生机制是什么？这个问题还不清楚。本研究首先建立了TMUV-ADE感染鸭的体内、体外发生模型。在体内，被动免疫的阳性血清浓度越高，ADE现象越明显。在体外，鸭抗TMUV阳性血清与TMUV预先孵育后再感染鸭外周血单个核细胞，病毒产量要高于单独病毒感染组，且100倍稀释的阳性血清ADE效应最显著。但在BHK21细胞和鸭胚成纤维细胞上，鸭抗TMUV阳性血清无ADE作用。应用免疫荧光比较细胞感染率的差异，感染后1h，ADE组感染细胞的数量大约是直接感染组的5倍。感染后24h，ADE感染组的病毒产量大约是直接感染组的17倍。将鸭抗TMUV各重组蛋白血清分别与TMUV孵育后感染鸭PBMCs，结果显示PrM、E和NS1蛋白是ADE感染相关抗原。鸭抗TMUV血清分别经热灭活处理，与EGTA和Zymosan A作用后破坏补体途径，其ADE作用都未受影响，证明TMUV的ADE效应是不依赖于补体的。提纯的鸭抗TMUV IgG也具有ADE作用，但其Fab'片段无ADE作用，说明TMUV的ADE感染是由IgG介导的，且依赖于Fc片段。将鸭IgG与鸭PBMCs膜蛋白进行免疫共沉淀及质谱分析，结果显示甘露糖受体1样蛋白和含Ig样结构域蛋白等可能参与IgG介导的ADE感染。应用转录组测序比较TMUV直接感染和ADE感染细胞内关键基因表达差异情况，筛选出62个显著差异表达基因，主要显著富集到防御反应、细胞因子介导的信号通路、I 型干扰素受体结合等，涉及的免疫系统通路有RIG-I样受体信号转导通路、NOD样受体信号转导通路等。应用qRT-PCR检测TMUV-ADE感染鸭PBMCs中模式识别受体及细胞因子表达情况，发现ADE感染可抑制RIG-I和MDA5的转录水平，IL-6、IL-10、IFN-α等细胞因子转录水平高于病毒直接感染组。综上，本研究建立了TMUV-ADE感染鸭的体内、体外发生模型，从eADE和iADE两方面初步阐明了TMUV-ADE的作用机制，为进一步优化疫苗设计，有效防控家禽的坦布苏病毒病提供理论依据。