坦布苏病毒感染引起鸭卵泡闭锁的分子机制研究

Tembusu virus (TMUV) infection is an emerging disease in ducks characterized by non-purulent encephalitis, acute ovaritis and follicle atresia. The infection caused severe egg drop in laying ducks but the the pathogenesis of the virus infection is largely unknown. In this project, in vivo infection experiments will be conducted to investigate the pathophysiological changes induced by TMUV infection.The hormone seretion/regulation in the infected ducks, microscopic lesions and cytological alterations of the ovaries will be tested. Our previous works that the cholesterol in the cell membrane plays an important role in TMUV infection, we hypothesize that the virus infection is closely related to the follicle cell cholestrol metabolism based on the fact that the perturbation of cholestrol homeostasis stimulates the follicle cell apoptosis and the ovarian follicle atresia in laying hens. The interaction of the virus with the host cholestrol metabolism will be investigated using the in vitro follicle granulosa/theca cell culture system.

水禽坦布苏病毒感染是我国近年来新发生的一种高致病性传染病，主要引起鸭和鹅的非化脓性脑炎、卵巢炎、卵泡闭锁和破裂，导致产蛋严重下降和停产，国内外对该病毒感染病理发生，引起产蛋鸭卵泡急性损伤的机制尚不清楚。基于本实验室前期研究结果，结合家禽卵泡的发育和生理特点，本项目拟以实验动物和体外细胞培养感染实验为模型，从坦布苏病毒感染鸭的激素分泌/调控变化、卵巢的病理组织学以及细胞免疫/炎性反应等方面深入研究感染鸭卵巢和卵泡急性损伤的病理发生过程，并利用体外培养鸭卵泡壁细胞为模型开展病毒感染与卵泡细胞脂质代谢及细胞炎性反应相互作用研究，目的是全面深入阐述鸭坦布苏病毒感染引起产蛋鸭卵巢损伤及卵泡闭锁的分子机制，为进一步开展家禽生殖系统感染的防治研究奠定基础。

TMUV自2010年在我国爆发以来给水禽养殖业造成了巨大的经济损失。为了探究TMUV感染导致产蛋鸭产蛋下降的发病机制，本研究观测了TMUV JXSP株感染产蛋麻鸭导致卵巢和卵泡变性的发病过程，并检测了病毒在产蛋鸭各组织内的复制动态，发现TMUV对产蛋鸭卵巢组织和卵泡膜层有较强的侵嗜性，而卵泡膜层细胞的病变可能是导致产蛋鸭等级卵泡闭锁和变性的关键。为探究病毒与卵泡膜细胞相互作用机制，本研究采用物理分离和胶原酶消化相结合和方法从产蛋鸭等级卵泡中成功分离获得大量的卵泡膜细胞，建立了鸭卵泡膜细胞体外培养和病毒感染体系，确证TMUV可在分离培养的卵泡膜细胞中迅速增殖并诱导产生明显的细胞病变。为深入探究TMUV感染与鸭卵泡膜细胞作用的分子机制，本研究利用RNA-Seq筛选和鉴定了TMUV感染12h和24h引起卵泡膜细胞差异表达基因（DEGs），结果显示TMUV感染12和24h分别了引起1419个和2125个DEGs差异表达。KEGG信号通路富集分析显示，差异表达基因主要富集到了与免疫系统、脂质代谢和转运以及卵巢卵泡发育相关的信号通路。值得注意的是，本研究发现TMUV体外和体内感染均能显著下调鸭卵泡膜细胞LHR基因的转录表达，说明TMUV感染可能影响黄体生成素（LH）对卵泡发育的生理调控。对病毒感染与细胞能量脂质代谢相互关系的初步研究表明TMUV感染可促进鸭卵泡膜细胞AMPK的活化，而抑制病毒诱导的宿主细胞AMPK的活化能够显著抑制病毒的增殖；利用钙离子通道抑制剂降低宿主细胞内游离钙离子的浓度显著抑制鸭坦布苏病毒的增殖，表明钙离子信号在TMUV感染宿主细胞过程中具有极其重要的作用。综上所述，本研究结果为进一步揭示TMUV感染导致产蛋鸭卵泡变性的发病机制提供了科学线索。