T-2毒素生物转化及毒性的分子机制研究

T-2毒素是由多种镰刀菌产生的单端孢霉烯族毒性化合物，其残留严重威胁我国人民的健康。本项目拟以猪及其原代肝细胞为实验对象，通过HPLC-MS/MS、酶联免疫、实时荧光定量PCR、二维-荧光差异凝胶电泳和基因干扰等分析技术和手段，探讨T-2毒素及其4种主要转化产物在猪肝脏的分布特征，确定参与T-2毒素的转化和毒性的效应基因；克隆并表征关键CYP450s酶基因。解析T-2毒素暴露所导致肝脏/原代肝细胞微粒体和线粒体两种亚组分的差异表达蛋白谱，找出T-2毒素暴露剂量与CYP450蛋白水平及酶活性变化的响应规律，并进一步验证其功能。通过本项目研究，可望发现T-2毒素暴露时新的CYP450s等关键效应基因，进一步揭示T-2毒素的生物转化及其毒作用的分子机制，寻找敏感、有效的暴露标记物，为T-2毒素的残留形成、防治途径及其在农产品中残留等安全性评价提供科学依据。

T-2毒素属单端孢霉烯族化合物，是该类毒素中毒性较强的一种，主要由镰刀菌产生。T-2毒素广泛存在于谷物食品中，人类和动物暴露T-2毒素会引发各种疾病，畜禽暴露T-2毒素还可能致动物源食品残留，间接危害人类健康。掌握该化合物的致毒机制对制定抗毒措施非常重要。本项目以不同剂量T-2毒素暴露的猪原代肝细胞为实验材料，运用基因芯片杂交和荧光差异双向电泳（2-D DIGE）结合MALDI-TOF MS/MS生物质谱分析技术，分别从基因和蛋白水平研究了T-2毒素对猪原代肝细胞的毒性效应及其机制，取得如下进展：.1. 0.05 μg/mL T-2毒素暴露猪原代肝细胞后共有1193个基因产生显著变化，包括562个表达上调基因和631个表达下调基因。这些变化的基因涉及氧化还原、免疫反应、转运、蛋白酶解、细胞粘附、脂类代谢、凋亡等多个生物学过程。用Real-time荧光定量PCR验证了参与肝脏外源物质代谢的P450家族基因(CYP3A39、CYP3A46和CYP2C42)以及环氧化物酶EPHX1和羧酸酯酶CES1C4基因，结果上述基因mRNA表达均呈现不同程度的升高，与芯片变化趋势相同，说明这些酶可能参与了T-2毒素的体内转化和代谢过程。.2. 运用荧光差异双向电泳（2-D DIGE）技术研究0.05 μg/mL T-2毒素暴露后猪原代肝细胞蛋白表达谱变化，发现了260个差异蛋白。选择剂量-效应明确，且界限清晰的蛋白点，采用MALDI-TOF MS/MS生物质谱技术进行鉴定，成功鉴定出84差异蛋白，包括34个表达上调蛋白和50个表达下调蛋白。用Gene Ontology、KEGG数据库以及Pathway StudioTM (v7.0)软件分析发现它们主要参与蛋白结合、电子传递、信号传导、应激反应、脂类代谢等生物学功能和信号通路。这些蛋白的改变可能与T-2毒素所致肝细胞损伤以及疾病形成过程有关。