异种脱细胞动脉基质修复猪肝外胆道缺损及良性狭窄的机制研究

Iatrogenic biliary tract injuries and complications relating to biliary surgery attract more attention than ever before because of applications of laparoscopic technicals and liver transplantation. In regard to biliary tract injuries, espacially defect of extrahepatic biliary tract, existed measures have positive effects, but the risk of complications, such as cholelithiasis and cholangitis, may be occurred more than once. In the past researches, we found that histological similarities between arterial tissue and biliary tract, moreover, arteries which under appropriate process, could be an excellent biological engeering scaffold, and it could be a carrier for induced cholangiocyte-like cells in vitro. This research will utilize arteries from donation after cardiac death(DCD) as materials, Diannan porcine in closed population as subjects, to build induced cholangiocytes in vitro and model of defect of extrahepatic biliary tract, then immunofluorescence scope will be used for observing the growth of cholangiocytes,which express EGFP by plasmid transfection on the decellurized arterila matrix, and foreign body reaction of decellurized arterial matrix in biliary system and non-biliary system, for instance, the subcutaneous tissue. The possible mechanism and clinical utilities of decellurized arterial matix to repair defect of extrahepacit biliary tract will be explored by immunofluorescence sopce, laser scanning confocal microscope protein profiling techiques.

腹腔镜技术的普及以及肝移植技术的应用，使医源性胆道损伤及胆道外科并发症逐渐引起了人们的重视。在面临胆道损伤，尤其是肝外胆道缺损时，现有的方法虽然有一定效果，但面临多次手术以及术后结石形成、胆道感染等并发症的风险。本课题组在以往的研究中，发现了动脉组织与肝外胆道组织结构上的相似性，并且经过合适处理的脱细胞动脉基质是一种良好的生物工程材料，能够在体外培养条件上作为承载诱导后的类胆管上皮细胞的生物材料。本课题拟采用无心跳供体捐献的动脉作为实验材料，选择封闭群滇南小耳猪，建立体外诱导胆管上皮细胞培养条件、肝外胆道缺损模型，通过免疫荧光显微镜动态观察质粒转染EGFP后类胆管上皮细胞在脱细胞动脉基质中的生长特点，并且观察脱细胞动脉基质在胆道系统及非胆道系统中所引起的异物反应，并且应用激光共聚焦显微镜、免疫荧光显微镜、蛋白质谱分析等技术研究脱细胞动脉基质修复肝外胆道缺损的可能机制以及后期临床应用的可能。

腹腔镜胆囊切除术的普及带来的胆总管损伤屡见报道。尽管胆总管空肠吻合术可以作为胆总管损伤补救手段，但并不是完美解决手段。因为胆总管空肠吻合术把胆汁顺畅引流到肠道的同时导致Oddi括约肌功能的丧失，Oddi括约肌功能的丧失导致肠道内容物连同细菌返流到胆管，从而出现反流性胆管炎反复发作、结石形成和胆管癌等一系列并发症。我们旨在制备新型组织工程化胆管进行了以下研究内容：1、使用0.25％胰蛋白酶、1％TritonX-100溶液、1％SDS溶液对DCD捐赠者动脉进行处理； 2、使用表皮生长因子（EGF）、干细胞生长因子（SCF）、白血病抑制因子（LIF）诱导肝干细胞定向分化；3、经过免疫荧光，冰冻切片，扫描电镜，PCR，Western Blot等方法检测了诱导分化的胆管上皮样细胞在脱细胞基质中沿胶原骨架生长和增殖情况；4、使用复合胆道上皮细胞的脱细胞基质对滇南小耳猪的胆道缺损模型的建立与修补，不同时间点取材做免疫荧光，病理切片，PCR，Western Blot，免疫组化等检测。结果：1、脱细胞处理后的人源动脉是理想的组织工程支架；2、肝干细胞在一定诱导条件下能够体外分化为活力良好的胆管上皮样细胞；3、胆管上皮细胞在脱细胞基质中能沿胶原骨架生长并保持其原有的细胞表型；4、脱细胞基质修复胆道缺损后，能够重建胆道上皮的完整性，降低术后狭窄的发生率。关键数据：人源脱细胞动脉基质与猪胆管上皮细胞联合培养4周后，猪胆管上皮细胞能在人源脱细胞动脉基质上稳定生长和增殖。利用再细胞化的人源脱细胞动脉基质修复猪的胆总管缺损，在预定的时间点（1周、2周、4周、8周、半年和1年）观察，胆汁顺畅引流进入十二指肠，未见胆汁漏以及胆道梗阻。科学意义：1、本课题应用的肝干细胞分化产生的胆管上皮样细胞，既能表现胆管上皮细胞的特性，又可保持其细胞活性，从而为胆道细胞的生长特性研究提供稳定细胞株；2、应用复合胆道上皮细胞的脱细胞动脉基质修复猪胆道的良好结果为新型组织工程化胆管在临床的应用奠定了坚实的实验与理论基础。