腹膜间皮细胞NLRP3炎性体活化在腹膜结构重塑中的作用及黄芪的干预研究

It is believed that constant exposure of the mesothelium to the bioincompatible constituents of PD solutions results in peritoneal membrane remodeling, which can lead to PD technique failure. PMCs NLRP3 inflammasome plays a pivotal role in this process. Our previous work has found that astragalus is able to ameliorate peritoneum inflammation and fibrosis. Moreover, it can inhibit the upstream signal pathway of NLRP3 inflammasome activation. Consequently, We propose research hypothesis as following: constant exposure of PMCs to abnormal metabolism environment leads to NLRP3 inflammasome persistent activation, which mediate peritoneal inflammation and remodeling. Furthermore, astragalus is able to protect PMCs by inhibiting NLRP3 inflammasome pathological activation .On the basis of our previous work, We intend to clarify the important role of NLRP3 inflammasome activation in peritoneal remodeling and the therapeutic effect of astragalus for the first time. This study may reveal new molecular mechanism of PMCs protection role of astragalus and provide a new strategy for delaying or even reversing peritoneal fibrosis, which may promote the progress of PD technology and expand the scope of clinical use of astragalus.

腹膜长期暴露于生物不相容性的腹透液中发生了结构重塑，并最终发生纤维化是导致腹膜透析（PD）技术失败的主要原因。腹膜间皮细胞（PMCs）NLRP3炎性体活化在此过程中发挥了核心作用。我们前期研究提示黄芪有抗炎、抗纤维化的作用并能阻断炎性体活化的上游信号。因此提出本研究科研假说：PMCs长期直接暴露于异常代谢环境中，NLRP3炎性体持续活化介导腹膜组织炎症和结构重塑；黄芪可以通过阻断PMCsNLRP3炎性体活化发挥腹膜保护作用。本研究在既往工作的基础上拟借助基因转染与敲除、免疫沉淀等分子生物学技术，首次阐明NLRP3炎性体活化在PMCs损伤和腹膜结构重塑中的作用以及黄芪的干预机制。该研究的实施有可能揭示黄芪保护PMCs新的分子机制，为拮抗甚至逆转腹膜纤维化提供新的策略，对促进PD 技术的发展具有重要意义并可能为拓展黄芪的临床使用范围提供理论依据。

研究背景及目的：腹膜长期暴露在生物不相容性的腹透液中发生了结构重塑，并最终发生纤维化是导致腹膜透析技术失败的主要原因。阐明腹膜纤维化发生的确切分子机制，对于提高腹膜纤维化的防治水平具有重要意义。本研究的目的是初步阐明NLRP3( Nod-like Receptor Protein 3)活化在含糖腹膜透析液诱导的腹膜间皮细胞表型转化中的关键作用 并探讨黄芪甲苷的干预作用。.方法：①人腹膜间皮细胞(HMrSV5)分别与不同含糖量的腹膜透析液（(1.5%，2.5%，4.25%)）孵育24小时，并用含糖4.25%腹膜透析液分别刺激HMrSV5不同时间（0h，6h，12h，24h，48h）。取细胞培养上清液用于ELISA分析，细胞裂解液用于western blotting分析；②构建稳定转染NLRP3 siRNA的人腹膜间皮细胞株，用含糖4.25%腹膜透析液刺激24小时，收集细胞，RIPA裂解后用于western blotting分析；③黄芪甲苷（Astragaloside IV，AS-IV）是黄芪主要有效成分。用不同剂量AS-IV处理4.25%腹膜透析液诱导的HMrSV5表型转化细胞模型，取细胞培养上清液用于ELISA 分析，细胞裂解液用于western blotting分析。④构建高糖腹膜透析诱导的腹膜纤维化大鼠模型，应用不同剂量黄芪干预，留取腹膜组织行HE,MASSON,免疫组化检测MMT和纤维化相关指标。.结果：①不同含糖量的腹膜透析液可以呈剂量依赖性的诱导腹膜间皮细胞炎症体活化，表现为细胞裂解液NLRP3, pro-IL-1β, IL-1β, caspase-1表达上调，而细胞培养上清中IL-18表达上调；②含糖腹膜透析液可以诱导人腹膜间皮细胞发生间皮-间充质细胞转分化（mesothelial-mesenchymal transition，MMT)，表现为上皮细胞标志物E-cadherin表达下调而间充质标志物vimentin, α-SMA表达上调；③通过转染NLRP3 siRNA 下调NLRP3表达后，炎症体活化被抑制细胞裂解液NLRP3, pro-IL-1β, IL-1β,, caspase-1表达下调，而细胞培养上清中IL-18表达下调，并且可以部分阻断腹膜透析液诱导的人腹膜间皮细胞MMT；④AS-IV可以剂量依赖性地抑制NLRP3炎症体的活化，并部分阻断腹膜